homyrouz.ru — Банкетный зал Хоми Роуз

ООО ЛАДА-ДИЗАЙН ХОЛДИНГ, Ставропольский район (ИНН 6382010601), реквизиты, выписка из ЕГРЮЛ, адрес, почта, сайт, телефон, финансовые показатели

Обновить браузер

Обновить браузер

Возможности

Интеграция

О системе

Статистика

Контакты

CfDJ8No4r7_PxytLmCxRl2AprPpeC8vU0gynckLWJCDPd3CDO2KTDejRx3a49xf5q-Y4PvBFNvs_k8bG5m98Ehlp-Hg0LaLwpf-qSxsAI1H8KVN7HBhQWqacV7PTF4Od2EmZOyS5j9dVZa9pguNGrMFWRa8

Описание поисковой системы

энциклопедия поиска

ИНН

ОГРН

Санкционные списки

Поиск компаний

Руководитель организации

Судебные дела

Проверка аффилированности

Исполнительные производства

Реквизиты организации

Сведения о бенефициарах

Расчетный счет организации

Оценка кредитных рисков

Проверка блокировки расчетного счета

Численность сотрудников

Уставной капитал организации

Проверка на банкротство

Дата регистрации

Проверка контрагента по ИНН

КПП

ОКПО

Тендеры и госзакупки

Юридический адрес

Анализ финансового состояния

Учредители организации

Бухгалтерская отчетность

ОКТМО

ОКВЭД

Сравнение компаний

Проверка товарных знаков

Проверка лицензии

Выписка из ЕГРЮЛ

Анализ конкурентов

Сайт организации

ОКОПФ

Сведения о регистрации

ОКФС

Филиалы и представительства

ОКОГУ

ОКАТО

Реестр недобросовестных поставщиков

Рейтинг компании

Проверь себя и контрагента

Должная осмотрительность

Банковские лицензии

Скоринг контрагентов

Лицензии на алкоголь

Мониторинг СМИ

Признаки хозяйственной деятельности

Репутационные риски

Комплаенс

Компания ООО ЛАДА-ДИЗАЙН ХОЛДИНГ, адрес: Самарская обл. , Ставропольский район, с. Узюково, ул. Ленина, д. 1 зарегистрирована 17.09.2002. Организации присвоены ИНН 6382010601, ОГРН 1026303943731, КПП 638201001. Основным видом деятельности является торговля розничная легковыми автомобилями и легкими автотранспортными средствами в специализированных магазинах, всего зарегистрировано 10 видов деятельности по ОКВЭД. Связи с другими компаниями отсутствуют.

Количество совладельцев (по данным ЕГРЮЛ): 1, ликвидатор — Вальдбауэр Вера Матвеевна. Размер уставного капитала 229 000₽.
Компания ООО ЛАДА-ДИЗАЙН ХОЛДИНГ не принимала участие в тендерах. В отношении компании нет исполнительных производств. ООО ЛАДА-ДИЗАЙН ХОЛДИНГ не участвовало в арбитражных делах.
Реквизиты ООО ЛАДА-ДИЗАЙН ХОЛДИНГ, юридический адрес, официальный сайт и выписка ЕГРЮЛ, а также 1 существенное событие доступны в системе СПАРК (демо-доступ бесплатно).

Полная проверка контрагентов в СПАРКе

• Неоплаченные долги
• Арбитражные дела
• Связи
• Реорганизации и банкротства
• Прочие факторы риска

Полная информация о компании ООО ЛАДА-ДИЗАЙН ХОЛДИНГ

299₽

• Регистрационные данные компании
• Руководитель и основные владельцы
• Контактная информация
• Факторы риска
• Признаки хозяйственной деятельности
• Ключевые финансовые показатели в динамике
• Проверка по реестрам ФНС

Купить Пример

999₽

Включен мониторинг изменений на год

• Регистрационные данные компании
• История изменения руководителей, наименования, адреса
• Полный список адресов, телефонов, сайтов
• Данные о совладельцах из различных источников
• Связанные компании
• Сведения о деятельности
• Финансовая отчетность за несколько лет
• Оценка финансового состояния

Купить Пример

Бесплатно

• Отчет с полной информацией — СПАРК-ПРОФИЛЬ
• Добавление контактных данных: телефон, сайт, почта
• Добавление описания деятельности компании
• Загрузка логотипа
• Загрузка документов

Редактировать данные

СПАРК-Риски для 1С

Оценка надежности и мониторинг контрагентов

Узнать подробности

Заявка на демо-доступ

Заявки с указанием корпоративных email рассматриваются быстрее.

Вход в систему будет возможен только с IP-адреса, с которого подали заявку.

Компания

Телефон

Вышлем код подтверждения

Эл. почта

Вышлем ссылку для входа

Нажимая кнопку, вы соглашаетесь с правилами использования и обработкой персональных данных

Директор по дизайну Lada рассказал о планах на Ниву — журнал За рулем

LADA

УАЗ

Kia

Hyundai

Renault

Toyota

Volkswagen

Skoda

Nissan

ГАЗ

BMW

Mercedes-Benz

Mitsubishi

Mazda

Ford

Все марки

Жан-Филипп Салар на АВТОВАЗе не так давно — он стал директором по дизайну с 1 января 2021 года.

Материалы по теме

Новые Niva и Grand Niva — названы цены

В этом видео самопрезентации дизайнер рассказал о своей работе над проектами для рынков Европы, Индии и Кореи. Своим главным достижением в Renault он считает дизайн Clio 3-го поколения, который он провел от начала до конца — от скетчей до производства. Потом он работал в Индии, где отвечал за все проекты для этого рынка. Под его руководством создавался доступный автомобиль для Индии Renault Kwid. Потом он переехал в Корею, где занимался дизайном

Renault Koleos, потом в Румынию, где проработал последние 5 лет и отвечал за разработку дизайна всей линейки Dacia: Duster, новых Sandero и Logan, и даже универсала Jogger, который презентовали совсем недавно.

Жан-Филипп Салар считает, что главный принцип дизайнера — соблюдение пропорций. Сначала нужно думать о них, а лишь потом работать над языком собственно дизайна и стилем. Стиль же непременно должен отвечать запросам клиентов.

Материалы по теме

Dacia Jogger — новые подробности о будущем Ларгусе

Он отметил, что ему нравится жить в разных странах, создавать машины для разных рынков, руководствуясь спецификой местного спроса. Креативность, непременно, должна соотноситься с желаниями покупателей.

«Сейчас я часть Лады, и наша следующая задача — разработка нового поколения Нивы, которая базируется на платформе группы Renault», — отметил Салар.

Сегодняшняя цель — создать отличный дизайн Лады, мощный и сильный. Над этим проектом работают специалисты АВТОВАЗА в Москве и Тольятти, и команда уже близка к тому, чтобы сделать «нечто по-настоящему крутое», заключил он.

• О смене приоритетов в Группе Renault, куда входит и Lada, в январе этого года рассказал генеральный директор Лука де Мео.
• «За рулем» теперь можно читать в ВКонтакте

Видео: YouTube

Наше новое видео

3 искренних заблуждения при перевозке детей

50 л/100 км, автомат, пневмоподвеска — тест самого народного автомобиля СССР

Под звон бутылок: тест самого душевного автобуса ЛиАЗ-677

Понравилась заметка? Подпишись и будешь всегда в курсе!

За рулем на Яндекс. Новости

Отзывы о LADA Niva (14)

Алексей

27 ноября 2021 года

LADA Niva 2017 / срок владения до 6 месяцев

Достоинства:

Только проходимость.И то, по сравнению с классической НИВОЙ она хуже.

Недостатки:

Сплошные недостатки!!!

Комментарий:

Написать отзыв

Новости smi2.ru

дизайнов, тем, шаблонов и графических элементов для загрузки на Dribbble

1. Посмотреть выходные

   Выходные дни

2. View FretX App — играйте на гитаре без проблем

   Приложение FretX — играйте на гитаре без проблем

3. Посмотреть 24 лада | Дизайн визитной карточки

   24 лада | Дизайн визитных карточек

4. Посмотреть Le Petit Fret

   Малый лад

5. Посмотреть логотип группы Ripchord

   Логотип Ripchord Band

6. Посмотреть безладовую птицу

   Безладовая курица

7. Посмотреть идею для печати «Не волнуйся»

   «Не волнуйся» Идея для печати

8. Посмотреть Le Petit Fret

   Малый лад

9. Посмотреть Le Petit Fret

   Малый лад

10. Посмотреть Le Petit Fret

    Малый лад

11. Посмотреть не ладить

    Лад без

12. Просмотр значка Fret foodtrucks

    Пиктограмма Fret foodtrucks

13. Просмотр значка бутербродов Fret

    Значок бутербродов Fret

14. Просмотр заводного лада

    Groovy Лад

15. Посмотреть ладонь масло макет с коробкой

    Масляный макет с коробкой

16. Посмотреть постер с ладами

    Плакат с ладами

17. Посмотреть лад

18. Просмотр значка картофеля фри

    Значок с картофелем фри

19. Посмотреть плакат Хосе Гонсалеса

    Плакат Хосе Гонсалеса

20. Посмотреть редизайн логотипа Fret

    Редизайн логотипа лада

21. Посмотреть Денди Лада

    Денди Лад

22. Просмотреть Слово Среда № 1: «Не волнуйтесь»

    Слово Среда #1: «Не волнуйтесь»

23. Посмотреть лад 12

    Лад 12

24. Посмотреть партизанские концерты

    Партизанские концерты

Зарегистрируйтесь, чтобы продолжить или войдите

Загрузка еще. ..

Зонды: конструкция и оптимизация датчика FRET

Из-за дифракции света в обычном микроскопе один флуоресцентный белок (FP) диаметром два нанометра будет выглядеть как размытый диск размером около 250 нанометров. широкий, говорит биофизик Джин Чжан из Калифорнийского университета в Сан-Диего (UCSD). Если два белка, несущих флуорофорные метки, приближаются друг к другу ближе, чем это расстояние, цвета будут перекрываться. Это свидетельствует о колокализации, но экспериментатор все равно не будет знать, соприкасаются два белка или взаимодействуют. Однако датчики резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) являются инструментами для изучения таких нюансов, поскольку они количественно сообщают о поведении.

«Прелесть FRET в том, что это происходит только тогда, когда два флуоресцентных белка находятся на расстоянии менее десяти нанометров друг от друга», — говорит Чжан. «FRET похож на крошечную линейку, которая позволяет нам более точно измерять расстояния между молекулами — если они достаточно близки, чтобы вы могли видеть FRET, то вы можете быть достаточно уверены, что они взаимодействуют». Этот аспект FRET в виде «молекулярной линейки» дает исследователям представление, выходящее за рамки взаимодействия двух белков, и, по ее словам, «именно поэтому датчики FRET являются таким невероятно мощным инструментом для клеточной биологии».

FP немного похожи на лампочки, с внешней оболочкой, окружающей тонкую внутреннюю нить, излучающую свет, говорит Джин Чжан из UCSD. Предоставлено: П. Ллевелин-Дэвис/OJO Images/Getty

Всегда включен

Небольшое количество биологов уже давно используют FRET, теория которого возникла в конце 1940-х годов, но серьезные успехи в разработке инструментов на основе FRET должны были отложиться до «брака» зеленого флуоресцентного белка (GFP) и FRET, говорит Ацуши. Мияваки, исследователь RIKEN и разработчик зондов. Сенсоры должны были быть, по словам лауреата Нобелевской премии Роджера Циена, «молекулярными шпионами». Циен разработал GFP и сгенерировал варианты GFP, которые расширили спектральный диапазон и популярность этих «шпионов» для расследования клеточных событий с близкого расстояния и с минимальным вмешательством ¹ . В середине 1990-х годов Мияваки, сотрудник лаборатории Tsien, разработал датчики, которые показывают большие изменения в эффективности FRET ² .

Датчики FRET не включаются и не выключаются; в какой-то степени они всегда «включены», что делает их немного похожими на циферблаты на приборной панели автомобиля, говорит исследователь из Стэнфордского университета и разработчик зондов Майкл Лин. Поведение, такое как взаимодействие двух белков, изменяет интенсивность флуоресценции сенсора (см. вставку 1, «Сенсоры FRET: доноры, акцепторы»).

Видимый метаболизм

Датчики FRET могут помочь лабораториям изучать метаболизм, например, метаболический поток фермента никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADH) на уровне отдельных клеток и субклеточном уровне. Кинетическая информация о НАДН и НАДФН трудно получить с помощью хроматографии или анализов ферментативного циклирования.

Используя характеристики датчика под названием SoNar, группа исследователей из нескольких учреждений Китая, включая Институт неврологии и Китайскую академию наук в Шанхае, разработала iNap, датчик для отслеживания небольших изменений клеточного NADP+ в NADPH 9. 0269 на месте . Ученые показали, что логометрическая флуоресценция увеличивается в девять раз, когда NADPH связывается с iNAP, а зонд подвергается воздействию возбуждающего света. Андреас Видеркер из Федеральной политехнической школы Лозанны и Николя Деморекс из Женевского университета отмечают, что такие данные отражают окислительно-восстановительное состояние клеток и тканей, которое может играть роль в заболевании ³ .

Наличие генетически закодированных датчиков для NAD+/NADH, таких как Frex, Peredox, RexYFP и SoNar, а также датчиков для NADP+/NAPH, таких как iNap и Apollo-NADP+, поможет лабораториям лучше понять кинетические изменения. И, как отмечают Видеркер и Деморекс, датчики открывают «новую эру» для мониторинга переходных изменений в окислительно-восстановительной сети.

Мембранные события

Катарина Гаус из Университета Нового Южного Уэльса и ее коллеги, в том числе научные сотрудники Юаньцин Ма и Джесси Гойетт, разработали MCS+, датчик FRET для отслеживания изменений заряда мембраны в живых клетках ⁴ . Сенсор остается прикрепленным к мембране, что ослабляет интерференционные сигналы от молекул в цитозоле и увеличивает отношение сигнал/шум сенсора. Команда использует датчик для изучения иммунологического синапса, где взаимодействуют антиген и Т-клетка.

Команда хочет изучить, как развиваются области заряда мембраны, говорит Гойетт. По словам Ма, существуют связи для изучения, связанные с зарядом мембраны и активацией Т-клеток, такие как снижение заряда мембраны, диссоциация ζ-цепи CD3 от мембраны и состояние ζ-фосфорилирования CD3, которое было предложено в качестве Модель «безопасность» при активации Т-клеток.

MCS+ предоставляет количественные данные о событиях. Перенос энергии между донорным и акцепторным флуорофором уменьшается по мере уменьшения взаимодействия между молекулой и мембраной. Конструкция датчика основана на R-pre, датчике на основе интенсивности флуоресценции с одним флуорофором. Эта идея пришла в голову команде после семинара Серджио Гринштейна, разработчика R-pre из Университета Торонто. Он описал проблему измерения заряда мембраны и уровней фосфатидилсерина во время фагоцитоза как с R-pre, так и с сенсором PS Lact-C2 GFP. При R-pre, когда заряд мембраны на клеточной плазматической мембране уменьшается, сенсор перемещается от плазматической мембраны к цитозолю. По словам Ма, это снижает интенсивность флуоресценции R-pre, которую трудно получить с помощью микроскопов, которые не позволяют делать дополнительные срезы, таких как традиционные эпифлуоресцентные микроскопы. Как только R-pre отходит от мембраны, он не сразу снова прикрепляется. По его словам, сдвиг заряда мембраны необходимо измерять на мембране постоянно или на расстоянии одного нанометра, поэтому они хотели, чтобы MCS+ оставался ассоциированным с мембраной.

Лаборатория все еще оптимизирует датчик — например, его динамический диапазон в живых клетках, — говорит Ма. Изменение сигнала FRET с помощью MCS+ в живых клетках, вероятно, является более сложным, чем хорошо контролируемые условия «эксперимента in vitro с мембраной на газоне», — говорит он. Локальный рН и ионную активность трудно предсказать в живых клетках. По словам Гойетта, решения о конструкции датчика FRET исходят из биологии, которую исследует лаборатория. Некоторые аспекты дизайна «могут быть по-настоящему обобщены».

Дизайнер, но капризный

Коллеги часто обращаются к нему за помощью в изготовлении датчиков FRET, — говорит Вольф Фроммер, разработчик датчиков из Дюссельдорфского университета им. Генриха Гейне. Основные этапы несложны: ПЦР, вставка в набор векторов, очистка белков после бактериальной экспрессии и измерение флуоресценции сенсоров ⁵ . Но, по его словам, «никто не имеет ни малейшего представления, как они на самом деле работают, поэтому конструкция носит эмпирический характер». Неожиданные события происходят даже с одномолекулярными генетически кодируемыми сенсорами кальция, такими как GCaMP. «Все, что это значит, — сделать множество конструкций и посмотреть, какие из них работают лучше всего», — говорит он.

Как объясняет Чжан, исследователи никогда не могут быть уверены, что при вставке компонента переключателя в каркас он будет работать. Поэтому необходима настройка датчика. По ее словам, несколько лабораторий работают над способами тестирования множества различных вариантов биосенсоров, что ускорит проектирование и оптимизацию, в том числе для ее новых датчиков FLINC ⁶ .

Вместе с Цзяном Мияваки совместно разработали FRET-сенсоры Ca ²⁺ , называемые камелеонами, которые представляют собой тандемные слияния сине- или циан-излучающего мутанта GFP, кальмодулина, кальмодулин-связывающего пептида M13 и усиленного зеленого или желтого излучающего ФП. Они предлагают хорошие ратиометрические характеристики двойного излучения. Камелеоны имеют много «потомков», говорит Мияваки, назвав их из-за того, насколько непредсказуемым был дизайн большинства конструкций. «Они были очень капризными, — говорит он.

На «хороших рисунках» может показаться, что датчик работает нормально, говорит Фроммер. Каркас может связывать глюкозу и изменять конформацию. На бумаге исследователи могли бы также изобразить слияние двух FP и ожидать «классического изменения»: чем ближе помеченные молекулы, тем больше FRET.

Но клетка содержит больше, чем исследуемые одиночные молекулы, а FP соединены линкерами с гибкими доменами. Следовательно, говорит Фроммер, «на самом деле мы измеряем многие молекулы». Увеличенное время визуализации и тот факт, что каждая молекула может принимать множество поз, затрудняют прогноз фактической суммы всех сенсорных структур. Линкеры могут различаться по длине и составу, что приводит к множеству вариантов в каждой позиции. «Мы используем набор конструкций с небольшими вариациями для создания библиотек и их проверки», — говорит он.

При проектировании и оптимизации датчиков FRET он рекомендует лабораториям оттачивать отношение сигнал-шум и чувствительность своих датчиков. «А это означает эмпирические улучшения», — говорит Фроммер. Он и его команда недавно разработали датчики Matryoshka с платформой, которую, по их мнению, можно обобщить для создания двойных ратиометрических биосенсоров FP ⁷ . Названный в честь русских матрешек, датчик имеет вложенную одиночную кассету FP под названием «Зелено-оранжевая матрешка». Он включает в себя излучающие зеленый и оранжевый FP: стабильный эталонный FP — большой стоксов сдвиг LSSmOrange — вложенный в репортер FP циклически переставленного GFP.

Команда считает, что конструкция обеспечивает более высокую чувствительность, динамику и диапазон обнаружения с лучшим соотношением сигнал-шум, чтобы помочь экспериментаторам исключить экспрессию или артефакты прибора при получении количественных данных in vivo . Команда протестировала свои MatryoshCaMP6 для мониторинга биологических процессов в проростках арабидопсиса , и исследователи видят возможности для применения этой стратегии для обнаружения небольших молекул, таких как сахара, аминокислоты, нейротрансмиттеры или гормоны.

MCS+ — датчик FRET для отслеживания заряда мембраны живых клеток. Кредит: Ю. Ма; J. Goyette, K. Gaus, Univ. Новый Южный Уэльс; E. Dewalt, Nature Research

Как объясняет Фроммер, при оптимизации сенсоров нужно учитывать многое. Добавление глюкозы к клеткам изменяет форму клеток, так что видимое изменение сигнала FRET может быть объяснено экспериментатором, который смотрит на другой срез изображения. Биосенсоры FRET сталкиваются с некоторыми ограничениями, такими как тот факт, что диапазон обнаружения, как правило, ограничивается двумя порядками концентрации анализируемого вещества; существуют ограничения динамического диапазона из-за размера конструкции ствола FP и того, как он ограничивает то, насколько близко могут подойти хромофоры; а усреднение вращения с помощью линкеров приводит к потере сигнала. По словам Фроммера, при выполнении тщательных количественных измерений с помощью датчиков FRET, включая датчики Matryoshka, исследователи должны быть уверены в стабильности эталонного флуорофора или YFP. «И контролирует, контролирует, контролирует», — говорит он. В идеале эти контроли являются генетическими мутантами.

Даже при отсутствии универсальной конструкции датчика FRET лаборатории могут следовать некоторым общим принципам, говорит Лин. Они захотят максимизировать расстояние между флуорофорами и минимизировать FRET в одном состоянии и минимизировать расстояние между флуорофорами, чтобы максимизировать FRET в другом состоянии.

Если есть два сенсорных домена, которые связываются друг с другом в присутствии сигнала, этого можно добиться с помощью длинного линкера между двумя сенсорными доменами, как это было показано в лаборатории Мацуда Киотского университета, говорит Лин. По его мнению, лаборатории могут модулировать сродство между флуорофорами, чтобы помочь им связываться друг с другом после того, как они впервые сблизятся друг с другом за счет конформационных изменений в сенсорных доменах. Это может дополнительно улучшить FRET в состоянии high-FRET. «Может быть полезно также попробовать несколько разных пар флуорофоров», — говорит он.

Решения по визуализации

Высокий уровень сигнала FRET сообщает исследователю, что два флуорофора находятся близко друг от друга — примерно в десяти нанометрах (см. вставку 1). Флуоресцентная визуализирующая микроскопия жизни (FLIM) добавляет к этой информации процент доноров, подвергающихся FRET, что дает лабораториям более точную количественную информацию. FRET можно использовать для открытия новых лекарств (см. вставку 2, «Расширение масштабов FRET»).

Группа Лин вместе с Риохеем Ясудой из Института Макса Планка во Флориде разработали пару FRET, которая может отображать два биохимических события одновременно, для использования с FRET–FLIM или в обычном FRET 9.0255 8 . Группа исследователей из нескольких институтов в Европе использовала in vivo FRET-FLIM, чтобы показать, как меченые факторы транскрипции в корнях Arabidopsis образуют комплексы, которые влияют на сегрегацию клеточных судеб в соседних клетках ⁹ .

Комментируя в целом FRET-FLIM, Мияваки говорит, что этот метод «чрезвычайно полезен, особенно для межмолекулярного FRET». Сравнивая выбор времени жизни и измерения изменения цвета, он говорит, что FLIM является более количественным, чем измерение, основанное на интенсивности. Как объясняет Ма, большая чувствительность FRET-FLIM к сигналам FRET по сравнению с логометрической визуализацией достигается за счет более длительного времени получения изображения. Теоретически оба метода нечувствительны к концентрации белка, но детекторы на основе фотоумножителей могут нелинейно реагировать на изменения интенсивности флуоресценции, что может привести к артефактам при логометрическом изображении.

Двойной отчет FRET-FLIM позволяет проводить одновременные измерения дендритных шипиков в ткани головного мозга гиппокампа мыши. Авторы и права: М. Лин, Стэнфордский университет; Р. Ясуда, MPFI

Один аспект, о котором следует помнить, говорит Гойетт, заключается в том, что сложные кривые затухания флуоресценции для доноров с методами на основе FLIM могут усложнить анализ. «Выбор донора с одним экспоненциальным временем жизни флуоресценции — хорошая идея», — говорит он. FRET-FLIM также требует специального оборудования, которое менее распространено, чем установка микроскопии для логометрических методов.

FRET-FLIM отлично подходит для обнаружения межбелковых взаимодействий в живых клетках, говорит Ма. Но в этих данных часто отсутствует информация о пространственном распределении молекул. Микроскопия сверхвысокого разрешения может предоставить эту информацию с нанометровым разрешением. Двухцветная визуализация со сверхвысоким разрешением использовалась, например, для обнаружения белок-белковых взаимодействий, но приходится идти на компромисс с временной информацией, потому что образец фиксирован.

Поразительное изображение, отражающее биологический принцип, «застревает в вашей памяти так, как не может гистограмма», — говорит Гойетт. Но соблазнительная сила красивых картинок может привести к плохому применению новых методов микроскопии, говорит он. Микроскопию сверхвысокого разрешения лучше всего выбирать, когда она подходит для интересующего биологического вопроса.

Вид в сверхвысоком разрешении

Нанодомены представляют собой интригующие, ограниченные клеточные области с кластерами из нескольких белков, которые контролируют многие биохимические процессы в клетках, говорит Чжан из UCSD. Для изучения этих реакций нужны датчики, но нанодомены слишком малы, чтобы их можно было увидеть с помощью конфокальной микроскопии. Альтернативой является микроскопия сверхвысокого разрешения, но она предлагает несколько способов наблюдения за реакциями нанодоменов по мере их возникновения. Это побудило ее разработать датчики FLINC, чтобы увидеть пространственную организацию биохимической активности в сверхвысоком разрешении.

FP немного похожи на лампочки, с внешней оболочкой, окружающей тонкую внутреннюю нить, излучающую свет, говорит Чжан, и эта нить чувствительна к изменениям в защитной среде внешней оболочки. FLINC имеет два FP: Dronpa, зеленый FP, и TagRFP-T, красный FP. Сам по себе TagRFP-T флуоресцирует ярко и стабильно. Когда Дронпа находится так близко, что внешние оболочки соприкасаются, оболочка ТагРФП-Т немного искажается, излучаемый ею свет тускнеет и начинает мерцать.

При записи в виде видеоролика эти флуктуации выглядят как беспорядочно вспыхивающие и гаснущие пятна, при этом каждый кадр видеоролика показывает разное подмножество мигающих пятен. Математически анализируя пятна и их мерцание по всей длине фильма, ученые могут количественно оценить колебания в каждом пятне и точно определить места с высокими колебаниями. Два пятна не мигают одновременно, что позволяет экспериментаторам различать пятна, которые находятся слишком близко, чтобы их можно было различить с помощью обычной флуоресцентной микроскопии.

Полученное в результате микроскопическое изображение со сверхвысоким разрешением и его богатством деталей нельзя было зафиксировать с помощью классических датчиков FRET, поскольку в них отсутствуют эти колебания флуоресценции, говорит Чжан. Даже с классическими датчиками FRET, которые имеют хорошее временное разрешение, «существует предел того, сколько пространственных деталей вы можете различить».

Датчики матрешки названы в честь русских матрешек. Датчик имеет вложенную одинарную кассету FP под названием Green-Orange Matryoshka. Кредит: В. Фроммер

Для разработки FLINC Чжан и ее команда использовали несколько обобщающий подход датчика FRET: пара FP размещается по обе стороны от другого белкового фрагмента, который действует как переключатель, открываясь и закрываясь в ответ на биохимический процесс в организме. клетка. Открытие и закрытие — это то, что контролирует расстояние между двумя FP. Поскольку и FRET, и FLINC могут иметь место только тогда, когда два FP близки, изменения сигнала FRET или FLINC указывают, когда происходит конкретный биохимический процесс. «Если вы измените идентификатор белкового переключателя, вы сможете обнаружить другой биохимический процесс», — говорит она. «Эта конструкция «сменных частей» — одна из вещей, которая делает эти датчики такими мощными и полезными», — говорит она.

Благодаря измерению времени жизни флуоресценции, FRET-FLIM делает FRET очень количественным, говорит Чжан, но FRET-FLIM может быть трудно сотрудничать с визуализацией сверхвысокого разрешения. По ее словам, в будущем возможно будет объединить классические биосенсоры FRET с визуализацией сверхвысокого разрешения. Но FRET очень полезен и без этого партнерства.

Датчики FRET открыли способы изучения многих процессов внутри живых клеток, говорит Чжан, но эта область еще может расширяться. Современные биосенсоры хороши для изучения отдельных биохимических процессов, происходящих в изолированных клетках, но все процессы в сложном организме включают взаимодействие между несколькими биохимическими процессами в данной клетке. Существуют взаимодействия между несколькими клетками в данной ткани или органе, а иногда и взаимодействия между несколькими тканями или органами. «Чтобы действительно понять, как работают все эти сложные процессы, нам нужны инструменты, которые позволяют нам «видеть» множество различных биохимических реакций одновременно в режиме реального времени и иметь возможность отслеживать эти процессы, как они происходят в неповрежденной ткани или живой ткани. животное, — говорит она.

Датчики FRET позволяют это «видеть», но ограничения включают тот факт, что датчики FRET обычно содержат два FP разного цвета, говорит Чжан. По ее словам, трудно визуализировать несколько датчиков FRET в одних и тех же клетках и предотвратить перекрытие их флуоресцентных сигналов, чтобы их стало трудно различить. Кроме того, во многих случаях экспериментальные сигналы FRET малы; «любые новые и усовершенствованные биосенсоры, обладающие более высокой чувствительностью или более простые в использовании для одновременной или «мультиплексной» визуализации активности, будут действительно важным достижением».

Блок 1: FRET-сенсоры: доноры, акцепторы

FRET-сенсоры могут быть бимолекулярными или мономолекулярными. Бимолекулярные конструкции лучше подходят для характеристики белок-белковых взаимодействий, тогда как мономолекулярные используются для изучения конформационных изменений белков, говорит исследователь RIKEN Ацуши Мияваки.

Источники: Майкл Лин, Стэнфордский университет; Ацуши Мияваки, RIKEN; Джин Чжан, UCSD. Авторы и права: А. Мияваки, RIKEN; З. Лапин, Э. Деволт, Nature Research

Для бимолекулярных датчиков FRET интересующий белок несет флуорофор, такой как флуоресцентный белок, излучающий голубой (CFP), и отдельный флуорофор, возможно, желтый FP, находится на другом белке. В мономолекулярном сенсоре к молекуле присоединены два флуорофора.

При взаимодействии или конформационном изменении и когда два флуорофора находятся на расстоянии менее десяти нанометров друг от друга, происходит передача энергии между одним флуорофором, который действует как донор, и другим флуорофором, как акцептором. Эта передача энергии через диполь-дипольную связь приводит к гашению излучения света донора и излучению света молекулой-акцептором. Выходной сигнал датчика FRET обычно является логометрическим и основан на этом измененном излучении донора и акцептора.

Вставка 2: Масштабирование FRET

Fluorescence Innovations (FI) — компания, основанная Грегори Гиллиспи, бывшим академиком, для коммерциализации разработанного им высокоскоростного спектрофотометра для анализа кривых затухания времени жизни флуоресценции. Он перевел FI из Бозмана, штат Монтана, в Миннеаполис, чтобы более тесно сотрудничать с разработчиком биосенсоров из Миннесотского университета и биологом Дэвидом Томасом. В 2015 году Томас стал соучредителем компании Photonic Pharma, которая планирует расширить платформу FI на основе FRET для высокопроизводительного скрининга живых клеток при поиске лекарств. По словам Гиллиспи, в полностью рабочем состоянии система будет измерять несколько лунок планшета в секунду.

«Мы не используем коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов, который лежит в основе почти всех систем FLIM, — говорит Гиллиспи. Вместо этого программное обеспечение прибора анализирует формы волны затухания времени жизни флуоресценции каждого импульса лазерного излучения, попадающего на образец. Записывая реакцию многих фотонных событий в заданный интервал времени, платформа выходит за рамки ограничений по скорости коррелированного по времени подсчета одиночных фотонов.

Гиллиспи нравится, насколько «исключительно чувствителен» FRET к расстоянию между донором и акцептором. Использование этой чувствительности позволяет обнаружить взаимодействие, возможно, событие связывания или структурное изменение, затрагивающее исследуемое соединение и мишень.