homyrouz.ru — Банкетный зал Хоми Роуз

1.  См.: Скворцов Н. А. Уничтоженные в Богородском уезде церкви. – М., 1901, с. 20-21 (№ 22). А также: Холмогоровы В. и Г. Исторические материалы о церквях и селах XVI–XVIII ст. Вып. V (Радонежская десятина). – М., 1886, с. 112-115 (№ 38). Любопытно, что авторы «Исторических материалов», не знали о былом упразднении храма.

2. Скворцов Н. А. Ibid, с. 21.

3. Савелов Л. М. Московское дворянство в 1812 году. – М., 1912, с. 199.

6. Демково болото

способов взаимодействия Escherichia coli Dps с ДНК по данным атомно-силовой микроскопии

Abstract

Многофункциональный белок Dps играет важную роль в ассимиляции железа и решающую роль в упаковке бактериального генома. Его мономеры образуют додекамерные сферические частицы, накапливающие ~ 400 молекул окисленных ионов железа внутри белковой полости и применяющие гибкие N-концевые концы каждой субъединицы для взаимодействия с ДНК. Осаждение железа — это хорошо изученный процесс, с помощью которого клетки удаляют токсичные ионы Fe ²⁺ из генетического материала и сохраняют их в легкодоступной форме.Однако способ взаимодействия с линейной ДНК оставался загадкой, а бинарные комплексы с Dps до сих пор не охарактеризованы. Широко распространено мнение, что Dps связывает ДНК без какой-либо последовательности или структурных предпочтений, но несколько линий доказательств продемонстрировали его способность дифференцировать экспрессию генов, которая предполагает определенную специфичность. Здесь мы показываем, что Dps имеет различное сродство к двум фрагментам ДНК, взятым из регуляторной области гена dps . С помощью атомно-силовой микроскопии мы обнаружили, что Dps преимущественно занимает термодинамически нестабильные концы линейных двухцепочечных фрагментов ДНК и имеет высокое сродство к центральной части разветвленной молекулы ДНК, самоорганизующейся из трех одноцепочечных олигонуклеотидов.Было высказано предположение, что Dps предпочитает связывание с теми областями в ДНК, которые обеспечивают больше контактных площадок для триады его ДНК-связывающего пучка, связанного с одной вершиной белковой глобулы. Насколько нам известно, это первое исследование, в котором был обнаружен нуклеоидный белок со сродством к разветвленной ДНК, типичным для участков генома с прямыми и инвертированными повторами. Поскольку такие структурные элементы являются повсеместной особенностью бактериальных и эукариотических геномов, они требуют особого внимания, но белковая система, эволюционно адаптированная для этой функции, еще не известна, и мы предлагаем Dps в качестве предполагаемого компонента этой системы.

Образец цитирования: Мелехов В.В., Швырева Ю.С., Тимченко А.А., Тутукина М.Н., Преображенская Е.В., Буркова Д.В. и др. (2015) Режимы взаимодействия Escherichia coli Dps с ДНК по данным атомно-силовой микроскопии. PLoS ONE 10 (5): e0126504. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504

Академический редактор: Дипанкар Чаттерджи, Индийский институт науки, ИНДИЯ

Поступила: 17 ноября 2014 г .; Одобрена: 2 апреля 2015 г .; Опубликован: 15 мая 2015 г.

Авторские права: © 2015 Melekhov et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все данные содержатся в бумага.

Финансирование: Работа поддержана Российским научным фондом (ОНО, грант 14-04-00985, http://rscf.ru/node/8), Министерством образования и науки Российской Федерации ( SSA, проект № 2504, http: // xn — 80abucjiibhv9a.xn — p1ai) и Российского фонда фундаментальных исследований (ONO, 13-04-00997, http://www.rfbr.ru/rffi/eng). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Все живые организмы используют определенные структурные белки, чтобы поддерживать свои геномы в функциональном состоянии и защищать их от повреждений различными физическими, химическими факторами и факторами окружающей среды.У эукариот основная ответственность за реализацию функциональности в безопасных условиях лежит на пяти положительно заряженных гистоновых белках, которые конденсируют или расслабляют определенные геномные локусы, взаимодействуя с ДНК без специфичности последовательности. У прокариот эту функцию выполняют 10–12 очень распространенных белков [1–3], которые взаимодействуют с ДНК, распознавая структурные особенности двойной спирали или даже связываясь со специфическими мотивами последовательностей в бактериальной хромосоме.

Всего около 170 000 молекул различных белков заботятся о структуре E . coli при экспоненциальном росте, а переход в стационарный режим сопровождается увеличением их количества до ~ 290 000 [1]. В быстрорастущих клетках наиболее распространенным нуклеоидным белком является Fis ( F Actor of и nversion s timulation), количество которых достигает 60 000 молекул на клетку. В голодных клетках внутриклеточный уровень Fis падает, в то время как доминирующим белком становится Dps ( D NA-связывающий белок p из клеток s tarved, 180 000 молекул на клетку) [1].Fis и по крайней мере четыре других структурирующих белка (IHF, Lrp, H-NS и его паралог StpA) распознают сайты, для которых может быть выведен консенсусный мотив [1, 4-7]. Два других нуклеоидных белка (CbpA и CbpB), а также H-NS и StpA связывают изогнутую ДНК [8–10]; в то время как HU ( H съедает стабильный белок и ) может образовывать комплексы с широким спектром различных геномных локусов, включая изогнутую, неупорядоченную, разорванную или крестообразную ДНК [11–13]. Информация о взаимодействии Dps с ДНК менее достоверна.Считается, что он образует только неспецифические комплексы с отрицательно заряженным сахарно-фосфатным остовом [1, 14–16].

Большинство архитектурных белков бактериального нуклеоида действуют как гомо- или гетеродимеры (Fis, HU, CbpA, IHF, H-NS и StpA). DnaA и CbpB (Rob) действуют как мономеры, в то время как Lrp и Dps могут образовывать большие олигомерные частицы. В этой паре Lrp ( L , реагирующий на эвцин, r egulatory p rotein) существует как смесь димеров, октамеров и гексадекамеров, равновесие которых зависит от присутствия лейцина, благоприятствующего конфигурации октамера.Сегмент ДНК, содержащий сайт связывания Lrp, оборачивается вокруг этого октамера, образуя структуру, подобную нуклеосоме [17]. Доминирующей олигомерной формой Dps является додекамер, который собирается из димеров [18] или тримеров [19]. Додекамеры прочно связываются с ДНК, но способность более мелких олигомеров образовывать аналогичные комплексы еще не была хорошо документирована.

Два белка, которые взаимодействуют со специфическими последовательностями в ДНК (Fis и Lrp), имеют классические ДНК-связывающие домены спираль-поворот-спираль [20, 21]; в то время как большинство нуклеоидных белков полагаются на «косвенное считывание», т.е.е. используют разные структурные модули для распознавания их сайтов связывания в зависимости от конформационных особенностей, опосредованных последовательностью [22–24]. В Dps E . coli эта функция в первую очередь приписывается гибким N-концевым хвостам [16], содержащим три остатка лизина в положениях 5, 8 и 10 и остаток аргинина в положении 18. Делеция первых 8 или 18 аминокислот резко снизилась. способность Dps связывать ДНК и агрегировать с другими молекулами Dps [15], но рентгеноструктурный анализ не выявил типичных ДНК-связывающих модулей на N-концевых концах или каких-либо других сегментах на поверхности белка [16].Таким образом поражает близость E . coli Dps к ДНК в настоящее время понимается как сильное электростатическое взаимодействие между положительно заряженными боковыми цепями гибких белковых модулей и отрицательно заряженным остовом ДНК.

Отсутствие N-концов (как у MsDps1 из Mycobacterium smegmatis [18, 19]) или их пониженная гибкость (как у MsDps1 из M . smegmatis [18], Dps Agrobacterium tumefaciens [25]). ] и молекулы DpsA / DpsB Lactococcus lactis [26]) изменили способ взаимодействия или снизили способность связывания / конденсации ДНК [27].Таким образом, в Dps A . tumefaciens N-концов иммобилизуются на поверхности додекамеров сеткой водородных связей и солевых мостиков, вызывая ингибирование их способности связывать ДНК [25]. В обоих L . lactis Dps белки на N-концах образуют короткие α-спирали [26], выступающие на поверхности белка, и связывают соседние субъединицы через солевые мостики и водородные связи. Эти α-спирали стабилизируют додекамерную структуру белка, а также участвуют во взаимодействии с ДНК, поскольку удаление первых 20 аминокислот из DpsA нарушает способность связывания ДНК.Но замена трех Lys в положениях 9, 15 и 16 на Glu не повлияла на взаимодействие с ДНК [26], вероятно, потому, что эти остатки в структуре α-спиралей «либо обращены, либо расположены параллельно» поверхности додекамера [ 26]. Dps-гомолог Helicobacter pylori (HP-NAP) не содержит положительно заряженного N-конца, но вместо этого имеет положительно заряженную поверхность белка, которая напрямую взаимодействует с молекулами ДНК [28]. Таким образом, способ связывания Dps-ДНК может отличаться для молекул Dps от разных бактерий, но электростатические взаимодействия, скорее всего, играют решающую роль в этих процессах.

Существует четыре теоретических модели, описывающих E . coli Взаимодействие Dps-ДНК на субмолекулярном уровне. Они основаны на данных, полученных с помощью электронной [14, 26, 29–32] или атомно-силовой [15, 18, 28] микроскопии с ограниченным разрешением. Первый был предложен Almiron et al. [14] для объяснения электронных микрофотографий E . coli Dps: комплексы ДНК, наблюдаемые как высокоупорядоченные двумерные сотовые массивы [14, 29].Модель предполагает образование двух связанных гексамерных колец мономеров Dps вокруг двойной спирали ДНК. Однако ДНК-индуцированная конформационная перестройка сферических додекамерных частиц или сборка гексамерных колец из димеров или тримеров еще не зарегистрированы. Вторая модель основана на наблюдении крупных сокристаллов Dps-ДНК [30, 31]. Это предполагает способность Dps образовывать стопку чередующихся слоев, внутри которых ДНК изолирована в полостях между соседними додекамерами.Такие сокристаллы были обнаружены в голодных клетках, содержащих огромное количество Dps [30], и имеют решающее значение для защиты ДНК от множества повреждающих агентов. Однако в экспоненциально растущих клетках Dps был обнаружен как белок, равномерно распределенный по всему нуклеоиду [33].

Третья модель учитывала тот факт, что при физиологических значениях pH как внешняя, так и внутренняя поверхности глобулы Dps заряжены отрицательно (IP = 6,01). Итак, белок должен отталкивать, а не привлекать ДНК. Поскольку присутствие ЭДТА ингибирует связывание ДНК, было высказано предположение, что это взаимодействие опосредуется мостиками, образованными ионами металлов между отрицательно заряженной поверхностью белка и скелетом ДНК [30–32, 34, 35].Хотя эта модель не учитывает функциональность положительно заряженных N-концов, ее, вероятно, можно рассматривать как наиболее универсальную, поскольку несколько линий доказательств указывают на зависимость образования комплекса Dps-ДНК от Mg ²⁺ [30–32, 34] или Fe ²⁺ [35]. Наконец, модель, предложенная К. Зетом [36], подчеркивает способность Dps к неспецифическому связыванию ДНК и предполагает, что ДНК навивается вокруг округлой додекамерной частицы гистоноподобным образом.

Нуклеоидные белки с последовательностью или структурной специфичностью участвуют в дифференциальной регуляции генов [37].Такая информация для Dps в основном отсутствует. Тем не менее, было задокументировано, что dps -нулевой мутант E . coli имел значительные изменения в профиле белка [14], и микроматричный анализ был проведен для мутанта dps -null S . enteritidis [38] выявил сотни генов с dps -зависимой транскрипцией. Мы также обнаружили, что делеция dps влияет на транскрипцию определенных генов, оставляя экспрессию других геномных локусов E . coli без изменений [39]. Все эти факты предполагают некоторую специфичность связывания Dps-ДНК, и здесь мы попытались пролить свет на эту проблему с помощью трех разных подходов, используя фрагменты ДНК разной длины, последовательности и структурной организации. Наша цель была подкреплена тем фактом, что Dps — уникальный белок в семействе структурирующих факторов, обеспечивающих не только физическую, но и химическую защиту от повреждающих агентов. Высококонсервативный ферроксидазный центр Dps обеспечивает секвестрацию токсичных ионов Fe ²⁺ , что позволяет избежать образования гидроксильных радикалов с помощью химии Фентона [40].Окисленные ионы железа затем накапливаются внутри белковой полости и могут высвобождаться при восстановлении. Эта полость может вместить более 400 оксидов железа и может содержать оксиды других металлов, которые изменяют ферромагнитные свойства минерализованного ядра. Итак, сейчас Dps рассматривается как весьма перспективная биомолекула для наноэлектроники, дающая возможность создавать наноустройства с калиброванными ферромагнитными частицами [41]. Некоторая специфичность в его способе взаимодействия с ДНК может быть очень благоприятной при разработке новых материалов с предсказуемым расположением этих частиц.

Материалы и методы

Очистка ДПС

Модель E . Ген coli dps амплифицировали с праймерами TAATTTCTAGAACATAACATCAAGAGG и AGCTCTAGATTTATTCGATGTTAG и клонировали в вектор экспрессии pGEMΔXba [42] с использованием сайта Xba I. Нуклеотидную последовательность рекомбинантного гена, которая не была модифицирована какой-либо меткой, проверяли прямым секвенированием. Экспрессия гена осуществлялась в E . coli BL21 (DE3) клетки, выращенные в среде LB в присутствии ампициллина (100 мкг / мл) при 37 ° C.Транскрипцию рекомбинантного гена индуцировали 0,02 мМ IPTG при OD600 0,4–0,6, и накопление белка позволяли в течение 12 часов. Его очищали с помощью ионообменной хроматографии (DEAE-Sephadex A-25, GE Healthcare, Швеция) и гель-фильтрации на Sephadex G-200 (Pharmacia, Швеция). Белок концентрировали на колонках Vivaspin 20 (Sartorius, Германия), диализовали против буфера для хранения, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA, 5% глицерина, и хранили в морозильной камере.Конечная чистота нативного белка была выше 95%.

Получение фрагментов ДНК

линейных фрагментов ДНК получали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК E . coli K12 MG1655 и праймеры (Евроген, Россия), перечисленные в таблице 1. После ПЦР эти фрагменты ДНК очищали от субстратов и праймеров с помощью 5% -ного ПААГ-электрофореза, экстрагировали и растворяли в воде milliQ. Концентрацию фрагментов ДНК определяли на спектрофотометре ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc., СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).

Разветвленные молекулы ДНК были образованы из двух или трех одноцепочечных олигонуклеотидов (Таблица 1), сконструированных таким образом, что каждая половина одного фрагмента была комплементарной половинкам одного или двух других фрагментов (Таблица 1). Олигонуклеотиды растворяли в 5 мМ растворе MgCl ₂ , плавили отдельно при 97 ° C в течение 5 минут, смешивали и дополнительно инкубировали при 97 ° C в течение 5 минут. Затем смесь переносили на водяную баню с температурой 70 ° C на 10 минут и давали постепенно остыть до комнатной температуры (4–5 часов).

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

ДНК-Dps получали смешиванием фрагментов ДНК с Dps в различных молярных соотношениях в 10 мкл буфера, который содержал 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 0,1 мМ EDTA и 50 мМ NaCl. Образованию комплекса давали возможность в течение 30 минут при 37 ° C. Эффективность связывания оценивали с помощью анализа сдвига геля, как описано в [43]. Электрофоретическое фракционирование проводили в 5% ПААГ в буфере ТВЭ (89 мМ Трис-HCl, 89 мМ Борная кислота, 2 мМ ЭДТА, pH 8.0) при 200–250 В и 70–110 мА. Полосы ДНК окрашивали бромидом этидия или AgNO ₃ .

Следы ДНКазы I

5’-концы праймеров dps _F1 и dps _R2 (таблица 1) были мечены ³² P с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (Thermo Scientific, Литва) и протокола производителя. ПЦР амплифицировали три фрагмента ДНК с парами праймеров ³² P- dps _F1— dp s_R1, dps _F1 — ³² P- dp s_R2 и dps _F2 — ^{dps _R2.Амплифицированные фрагменты экстрагировали из геля, как описано в [44]. Перед образованием комплекса образцы ДНК (1 пмоль на реакцию) инкубировали в течение 10 минут при 37 ° C в 30 мкл буфера для транскрипции, содержащего 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 0,1 мМ EDTA, 0,1 мМ DTT, 10 мМ MgCl ₂ , 50 мМ NaCl и 5 мг / мл БСА (Sigma, США). Затем добавляли белок Dps в 2–10-кратном молярном избытке и оставляли взаимодействие в течение 40 минут при 37 ° C. Затем образцы обрабатывали 1 мкг / мл ДНКазы I в течение 2 минут.Расщепление прекращали добавлением 35 мкл 8 М ацетата аммония. Продукты переваривания ДНКазой 1 осаждали этанолом, растворяли в формамидном буфере [44] и наносили на 6% денатурирующий полиакриламидный гель. Образцы фракционировали в буфере TBE и визуализировали с помощью радиоавтографии. Гели калибровали по лестнице G-секвенирования.}

Пробоподготовка для атомно-силовой микроскопии (АСМ)

Сохраненные растворы очищенных Dps пропускали через колонку Sephadex G-15 (1×5 см ³ ) для удаления любых агрегированных частиц.Собранные фракции разбавляли в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5) и 10 мМ NaCl, до конечной концентрации 1 нг / мкл (4,4 нМ додекамеров) и 2 мкл этого раствора наносили на слюду для сканирования. Линейные фрагменты ДНК или Y-образные структуры растворяли в 5 мМ MgCl ₂ до концентрации 1 нг / мкл (4-19 нМ). Комплексы Dps с различными фрагментами ДНК формировали при комнатной температуре в буфере: 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ NaCl и 5 мМ MgCl ₂ (10 мкл) в течение 30 минут и наносили на слюду.Для образования комплекса использовали трех-десяти молярный избыток линейных фрагментов ДНК или пятидесяти молярный избыток разветвленных молекул. Аналогичным образом готовили контрольные образцы, но без Dps. Все образцы выдерживали на слюде в течение 5 минут, дважды промывали водой в течение 30 секунд, сушили и структуру образовавшихся комплексов анализировали на АСМ Интегра-Вита (НТ-МДТ, Россия) с использованием кантилеверов NSG03 с радиусом кривизны кончика 10 нм и Резонансная частота 47–150 кГц. Измерения проводились в полуконтактном (постукивающем) режиме.Полученные изображения анализировали с помощью программы Nova (NT-MDT, Россия).

Получение разорванной ДНК

Для наблюдения комплексов Dps с ДНК, содержащей одноцепочечные разрывы, 10 мкг плазмиды pET28b обрабатывали никазой Nt.BspD6I [45]. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ MgCl ₂ , 150 мМ KCl, 1 мМ DTT и 10 единиц никазы или равный объем буфера для хранения Nt.BspD6I (10 мМ Tris- HCl, pH 7,5, 50 мМ KCl, 0,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 50% глицерин) для экспериментального или контрольного образца соответственно.Переваривание было разрешено в течение 1 часа при 55 ° C. Плазмидную ДНК немедленно собирали экстракцией фенол-хлороформ, осаждали этанолом и растворяли в воде. Кривые плавления были получены для обеих плазмид, что подтвердило образование трещин. Комплексы с Dps в молярном соотношении Dps: ДНК 5: 1 или 10: 1 получали, как описано выше.

Результаты

Dps имеет разное сродство к двум фрагментам промоторной области

Уже известно, что делеция dps изменила профиль белков в голодном E . coli [14] и изменил профиль транскрипции в S . enteritidis [38] и E . coli [39]. Но этот очевидный регуляторный эффект может быть опосредован взаимодействием с регуляторными белками, занимающими их сайты связывания, которые высвобождаются в мутанте dps -null. Другими словами, данные, полученные in vivo , наводят на размышления, но их недостаточно для отказа от традиционной точки зрения, согласно которой Dps взаимодействует с ДНК без какой-либо специфичности [1–3, 14–16].Мы также ранее обнаружили, что две A / T-богатые области, содержащие « промоторный остров » yeaI и промоторы dps , имеют более высокое сродство к Dps, чем два линейных фрагмента ДНК, представляющих кодирующие последовательности и межгенное пространство, расположенное между конвергентными генами [ 46]. Эти эксперименты были выполнены in vitro , в отсутствие какой-либо конкуренции с регуляторными белками, что увеличивало возможность селективного взаимодействия. Поскольку факторы транскрипции обычно влияют на экспрессию собственных генов, регуляторная область dps была выбрана как наиболее многообещающий кандидат для демонстрации «специфического» связывания.Таким образом, фрагмент 420 п.н., охватывающий регуляторную область гена dps и взаимодействующий с белком Dps, был разделен на две половины. Один (длиной 259 п.н.) был получен методом ПЦР с праймерами dps _F2 и dps _R2 (таблица 1) и включал основной промотор этого гена — P _dps [47, 48]. Другой (длиной 214 п.н.) содержал дистальный промотороподобный сайт P3, который демонстрировал низкую транскрипционную активность, но был важен для максимальной экспрессии dps [49].

Поскольку ДНК-связывающая активность Dps обычно сопровождается самоагрегацией, а агрегированные комплексы не попадают в гель [1, 14, 19, 35, 39, 49], эффективность связывания оценивали на основе оставшейся свободной ДНК. несвязанный. Используя смешанные анализы, содержащие обе половины регуляторной области в одном образце, мы обнаружили, что фрагмент с функциональным промотором имеет более высокое сродство к Dps, чем дистальная часть регуляторной области (рис. 1A). Таким образом, стало ясно, что, образуя комплексы со всеми протестированными фрагментами ДНК [39], Dps может с определенной селективностью связываться с промоторной областью собственного гена.Затем мы попытались локализовать сайт связывания Dps в этой области с помощью техники отпечатков ДНКазы I (рис. 1B). Но обнаружив несколько гиперреактивных сайтов и наблюдая четко защищенные R1- и F2-концы (схема на рис. 1C) в обоих небольших фрагментах при большом молярном избытке Dps (10-кратный), при 5-кратном избытке мы обнаружили только несколько защищенных полос (~ 175 и ~ 113 п.н. ниже праймера dps _F1 и в области 120–151 п.н. выше праймера dps _R2). Последний воспроизводимо наблюдался в комплексах как с короткими (F2-R2), так и с длинными (F1-R2) фрагментами, предполагая некоторую специфичность в этом связывании.Вот почему на следующем этапе мы использовали атомно-силовую микроскопию (АСМ) для характеристики общей топологии комплексов Dps-ДНК.

Рис. 1. [A]: Пример анализа сдвига электрофоретической подвижности, выполняемого, как описано в разделе «Материалы и методы».

Один пмоль фрагмента ДНК длиной 214 п.н., амплифицированного с праймерами dps _F1 и dps _R1 (обозначенный как F1-R1), загружали только на дорожку 1 в качестве независимого маркера. Другие образцы содержали два фрагмента (по 1 пмоль каждый) и Dps, как указано выше на фотографии.Гель калибровали по маркерной лестнице (M). [B] Анализы футпринтинга ДНКазы I, выполненные для комплексов Dps с фрагментами ДНК F1-R1, F2-R2 и F1-R2. ³² Р-меченых праймеров отмечены звездочками. Гели калибровали по продуктам лестницы G-секвенирования. Позиционные метки показывают расстояние до ³² P-меченных праймеров F1 или R2. Защищенные сайты отмечены пунктиром. Гиперреактивные сайты не помечаются. [C] : Схема, иллюстрирующая относительное расположение и структурную организацию проанализированных фрагментов.Прямые и инвертированные повторы в их последовательностях усилены и дополнительно обозначены стрелками. Соответствующие полосы в [B] обозначены открытыми и серыми стрелками для прямых и инвертированных повторов соответственно. Изогнутая стрелка указывает сайт начала транскрипции в промоторе P _dps .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g001

Взаимодействуя с линейными фрагментами ДНК Dps обычно связывает концы двухцепочечных молекул

Фиг. 2A демонстрирует изображения очищенного Dps с помощью АСМ.Большинство наблюдаемых частиц имели квазисферическую форму с высотой около 7 нм, что хорошо согласуется с ожидаемым размером [16]. Расчетный вертикальный размер разложенных молекул ДНК составлял 2 нм ( Fig 2B – 2D ) , что также точно соответствует ожидаемому значению. Однако планарные размеры на АСМ-изображениях зависят от конечного размера острия кантилевера (в нашем случае R = 10 нм), а точность их измерения зависит от размера объекта. Таким образом, видимые диаметры белковых частиц в плоской проекции составляли 27–32 нм, кажущаяся ширина двойной спирали ДНК — ~ 21 нм, а длины ДНК-фрагментов 214, 259 и 420 п.н. составляли 76, 93 и 146 нм, т.е. .е. лишь немного больше ожидаемых значений (73, 88 и 143 нм соответственно). Таким образом, длину длинных молекул ДНК можно оценить достаточно точно.

Рис. 2. Изображения АСМ.

[A] : белок Dps; [BD] : ДНК-фрагменты, содержащие соответственно полную регуляторную область гена dps (420 п.н., праймеры dps_ F1 и dps_ R2), его проксимальный (259 п.н., праймеры dps_ F2 и dps_ ). R2) и дистальной (214 п.н., праймеры dps_ F1 и dps_ R1) части.Панели b и c : комплексы, образованные Dps с 214 п.н. (b) и 259 п.н. (c) ДНК-фрагментами. Белые шкалы представляют 100 нм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g002

Все образцы белка оказались довольно однородными, обычно содержащие менее 20% частиц меньше, чем додекамеры. Удивительно, но они не были загрязнены фрагментами ДНК, плотное связывание которых составляло , ранее ожидаемое [14, 15], или агрегатами (рис. 2А).Однако образование комплекса с ДНК спровоцировало сильную агрегацию. Удаление агрегатов путем промывки образцов слюды позволило зарегистрировать индивидуальные комплексы Dps как с короткими фрагментами ДНК, так и с использованием анализа сдвига электрофоретической подвижности и отпечатков пальцев (рис. 1). В обоих случаях мы наблюдали взаимодействие белковых частиц с концами молекул ДНК (рис. 2B и 2C). Мы не видели ни одного упорядоченного двумерного массива, зарегистрированного ранее с помощью электронной микроскопии [14, 29–32, 34, 36].Но это было ожидаемо, поскольку такие комплексы никогда не наблюдались с помощью АСМ [15, 18, 28], и мы намеренно удалили агрегаты путем интенсивной промывки. Мы также не обнаружили гексамерных колец, охватывающих ДНК [14], или убедительных доказательств того, что нуклеосомоподобная ДНК обвивается вокруг сферических частиц Dps [36], которые ожидались в рамках существующих моделей. Но мы также не обнаружили большого количества молекул Dps, взаимодействующих с внутренними частями линейных фрагментов ДНК. Даже если такие комплексы могут быть специфически вымыты агрегированным белком, стало ясно, что Dps может связывать концы двухцепочечной ДНК.Поскольку фрагменты F1-R1 и F2-R2 перекрываются на 53 п.н. в их A / T-богатых концах R1 и F1, в то время как две другие области с высоким содержанием A / T соответствуют оставшимся двум областям контакта с Dps (рис. 1B и 1C), мы предположили, что более высокое сродство этого белка к F2- Фрагмент R2 (рис. 1А) тривиально объясняется его более низкой термодинамической стабильностью (65 и 58% для фрагментов F2-R2 и F1-R1 соответственно).

Y-образные разветвленные конструкции — идеальные мишени для Dps

Две конструкции использовали для оценки сродства Dps к A / T-богатой ДНК.Один из них был построен из 2 синтетических олигонуклеотидов Y1 (57 n) и Y3 (64 n) (таблица 1) как искусственная модель концов ДНК. Он имел стабильный G / C-ствол и две гибкие одноцепочечные ветви, одна из которых состояла из аденинов (рис. 3A). Если Dps имеет повышенное сродство к одноцепочечной ДНК, мы ожидали найти его в комплексе с этими одноцепочечными ветвями, в то время как G / C-стебель может выступать из образованных комплексов. Другая конструкция была построена из олигонуклеотидов Y1, Y2 и Y3 (таблица 1) и содержала три ветви.Две длинные ветви в этой молекуле имели только пары оснований G / C, в то время как короткая содержала только пары A / T и могла быть идеальной мишенью для концевого специфического взаимодействия (Рис. 3B). В этом случае мы ожидали найти Dps в конце короткой ветви.

Рис. 3. Комплексы, образованные ДПС с четырьмя искусственными разветвленными конструкциями, схематически тонут на каждом участке.

Последовательность цветных кружков соответствует последовательности использованных олигонуклеотидов (таблица 1). Панели демонстрируют изображения АСМ, полученные для свободных образцов ДНК и их комплексов с Dps (левое и правое сканирование соответственно).Сборку конструкций ДНК и формирование комплекса выполняли, как описано в разделе «Материалы и методы». Вставка на правой панели Рис. D иллюстрирует трехмерное изображение комплексов, образованных триплексом Y5_Y6_Y8. Хорошо видны концы всех трех ветвей. Белые полосы представляют масштабы 100 нм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g003

На левой панели на рис. 3А показан пример свободных молекул ДНК, собранных из праймеров Y1 и Y3. Все они выглядят как зерна, но не как молекулы Y-образной формы.Это может быть связано со способностью гуанинов к квазикомплементарному взаимодействию с аденинами и гуанинами. В результате кажущийся продольный размер большинства наблюдаемых частиц составляет около 25 нм, что меньше, чем ожидалось для полностью вытянутого дуплекса (32 * 0,34 + 32 * 0,59 = 29,8 нм). Также возможно, что эти бинарные комплексы по своей сути гетерогенны, поскольку 3′-концевой C Y1 может связывать не только 5′-концевой G Y3, но также и любой другой гуанин в его поли G-последовательности, тем самым создавая смесь разные дуплексы.Однако все они должны содержать хотя бы небольшую часть одноцепочечной ДНК. Помимо зерен длиной 25 нм, мы также наблюдали более мелкие частицы с размером в диапазоне 13–20 нм, которые могут представлять собой одиночные олигонуклеотиды, образующие квадруплексы или другие вторичные структуры.

Добавление Dps изменило структуру этих частиц. Однако вместо обнаружения ожидаемых двухцепочечных спиралей, вытянутых из бинарных комплексов, мы наблюдали 2–4 неупорядоченных одноцепочечных хвоста ДНК (Рис. 3A).Эти хвосты имели видимую длину ~ 14–60 нм. Если принять во внимание ожидаемые ошибки в плоских проекциях, их можно рассматривать как два олигонуклеотида с расчетной длиной 34 и 38 нм, прикрепленные своими концами или внутренними частями к N-концам (или поверхности) Dps, или как одноцепочечные ветви. двух Y-образных молекул, одновременно взаимодействующих с одним белком. В обоих случаях максимальная длина наблюдаемых одноцепочечных хвостов больше, чем одноцепочечных ветвей в правильно собранном дуплексе (15–20 нм), что указывает на то, что начальное связывание Dps с зерноподобными частицами было достаточно сильным, чтобы перестроить их структура и удерживать неупорядоченные молекулы.

разветвленных молекул ДНК на фиг. 3B были собраны из праймеров Y1, Y2 и Y3 (таблица 1). Они сформировали конструкции, напоминающие Y-образную форму (левая панель), но состояли из асимметричного модуля V-образной формы и меньшего домена, связанного с основной частью. Размер этого ассоциата точно соответствовал мелким зернам на рис. 3A, в то время как длина модуля V-формы варьировалась в диапазоне 24–30 нм (ожидаемый размер в самом длинном измерении составлял: 64 * 0,34 = 21,8 нм) и среднее соотношение между двумя сторонами было равно 0.88 (ожидаемое значение: 57/64 п.н. = 0,89). Таким образом, существует вероятность того, что самосборка наблюдаемых частиц происходила через образование комплементарного триплекса, связанного с дуплексом неканоническим спариванием оснований. Электрофоретическое фракционирование этих комплексов действительно выявило две полосы, соответствующие триплексу и дуплексу (рис. 4, дорожка 1). Более короткая сторона V-образного модуля (Рис. 3B), скорее всего, соответствовала A / T ветви, в то время как одна G / C ветвь была конформационно скрыта и могла контактировать с небольшим ассоциатом.Ориентация триплекса по отношению к этому ассоциату была случайной, предполагая, что они собираются независимо от олигонуклеотидов. Смесь собранных молекул также содержала 10–20% более крупных частиц Y-образной формы (длина: 53–62 нм, высота: в среднем 2,6 нм), вероятно, образованных из триплексов и дуплексов, уложенных стопкой из-за квазикомплементарного взаимодействия квадруплексного типа вдоль G-прядь.

Состав образцов и молярное соотношение Dps: ДНК указаны над фотографиями. Молекулы разветвленной ДНК собирали из указанных олигонуклеотидов, смешанных в равных концентрациях (2–5 пмоль каждый), и получали, как описано в разделе «Материалы и методы». Без предварительного фракционирования их использовали для образования комплекса с Dps. Количество Dps было выбрано исходя из предположения, что все олигонуклеотиды образуют триплекс, как в случае Y5_Y6_Y7. Следовательно, указанные молярные отношения для Y1_Y2_Y3 завышены.Гели калибровали с помощью маркерных фрагментов ДНК (M) и окрашивали AgNO ₃ , чтобы визуализировать как молекулы ДНК, так и Dps.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g004

Обе Y-образные структуры взаимодействовали с Dps, но белок в этом случае обнаружен только в центральной части разветвленных искусственных конструкций (правая панель на рис. 3Б). В составных комплексах он не препятствует связыванию с концом A / T- или G / C ветви верхней молекулы.Но небольшие конструкции с кажущимся размером 24-30 нм также не обнаруживают концевого специфического связывания (вставки на правой панели фиг. 3B). Поскольку размер этих конструкций был такой же, как кажущийся диаметр Dps в плоской проекции, они были почти полностью покрыты белком, хотя концы всех трех ветвей были видимыми и идентифицируемыми.

Чтобы сравнить сродство Dps к триплексу Y1_Y2_Y3 и соответствующим бинарным структурам, мы приготовили смесь их самоорганизованных молекул и, без фракционирования, подвергли ее взаимодействию с Dps (дорожки 1-3 на рис. 4).Трехкратный молярный избыток белка был достаточен для связывания всех образованных триплексов, в то время как большинство дуплексов оставалось свободным. Основываясь на этих данных, мы предположили, что Dps может связывать одноцепочечную ДНК и даже плавить двойную спираль (рис. 3A), но разветвленные конструкции, которые обеспечивают дополнительную двухцепочечную платформу для взаимодействия с положительно заряженными N-концами, могут быть более предпочтительными мишенями.

Затем мы обнаружили, что способ взаимодействия, зарегистрированный для конструкции Y1_2_3 (рис. 3B), не был следствием ее конкретной первичной структуры, поскольку молекулы Y-формы строятся из олигонуклеотидов с природными последовательностями Y5, Y6 и Y7 или Y8, образующими один и тот же тип. комплексов.Первая половина Y5 (32 нуклеотида) и последняя половина Y6 были взяты из перекрывающейся части фрагментов F1-R1 и F2-R2 (рис. 1C). Самосборка этих 96 bp-конструкций (пример для Y5_Y6_Y7 на фиг. 4, дорожка 4) была намного более эффективной, чем в случае триплекса Y1_2_3 (фиг. 4, дорожка 1). Поэтому в смеси осталось очень небольшое количество дуплексов. Тем не менее, при 2-кратном молярном избытке белка, когда количество триплексов значительно снижается, несвязанные дуплексы все еще обнаруживаются (дорожка 6).Таким образом, вероятно, что среди разветвленных молекул с одно- и двухцепочечными разветвлениями Dps в основном выбирает последние.

Две модификации были использованы для повышения качества АСМ-изображений, полученных для комплексов Dps с разветвленной ДНК. Во-первых, мы добавили 26 нуклеотидов к 5’-концу Y5 и 3’-концу Y6 (9 нм), чтобы увеличить длину триплекса (Таблица 1 и Рис. 3C). Сайт, защищенный Dps против ДНКазы I, который расположен на 175 п.н. ниже праймера dps _F1 (фиг. 1B и 1C), был таким образом включен в конструкцию.В результате мы наблюдали комплексы с четко видимыми одной или двумя ветвями ДНК (рис. 3С, два правых столбца). В первом случае Dps может быть прикреплен к точке ветвления или к концу одного из коротких плеч, тогда как во втором случае взаимодействие с точкой ветвления кажется более вероятным, но третье плечо было плохо видно. Затем мы заменили динуклеотид TT во внутренней части Y_7 на AA (олигонуклеотид Y8). В результате новый триплекс Y5_Y6_Y8 имел короткую однонитевую петлю в одной ветви. Эта модификация немного сместила связанный белок от центра (рис. 3D), показывая концы всех трех ветвей (см. Трехмерное изображение на рис. 3D).Следовательно, Dps связывает 3-стороннее соединение и, вероятно, обладает определенной специфичностью по отношению к одноцепочечным или гибким участкам ДНК. Если это так, связывание Dps с одноцепочечными разрывами в природной ДНК может вызвать плавление, подобное тому, которое наблюдается на фиг. 3A. Чтобы проверить эту возможность, мы проанализировали комплексы, образованные Dps, с нативной и разорванной плазмидой pET28b.

Одноцепочечные разрывы в природной ДНК не были нарушены Dps

Очищенная плазмида pET28b выглядела как нативная и сильно свернутая молекула (фиг. 5A).Он расщеплялся сайт-специфической никазой Nt.BspD6I, которая распознавала девять последовательностей GAGTC и делала одноцепочечные разрывы в верхней цепи на четыре основания по направлению к 3’-концу [50]. В результате плазмида стала расслабленной и даже фрагментированной (рис. 5В), поскольку несколько сайтов связывания близко расположены в этой ДНК. Комплексы с Dps образовывались при 5- и 10-кратном молярном избытке додекамеров Dps. Более высокое соотношение обеспечивало присутствие комплексов, образованных с разрезанной и неразрезанной ДНК, и позволяло обнаружить их различие, если таковое имеется, в то время как более низкое соотношение давало возможность увеличить долю комплексов, образованных с предпочтительными сайтами.Плотность связанных молекул Dps при 10-кратном избытке белка была выше на разорванной плазмиде по сравнению с нативной: 1 молекула на 117 ± 12 нм против 135 ± 23 нм соответственно (расчетная длина плазмиды 1917 нм). . Хотя разница не была статистически значимой, она соответствовала ожидаемому вкладу зарубок. Однако бинарные комплексы с додекамерами Dps в обоих случаях были очень похожи, и тщательное исследование не выявило одноцепочечных хвостов вблизи связанного белка (рис. 5C и 5D).

Рис. 5. Примеры нативной (A, C) и разорванной (B, D, E) плазмиды pET28b в свободном состоянии (A, B) и образующих комплексы с Dps (C-E) .

Белые полосы изображения в масштабе (нм). Горизонтальные и вертикальные стрелки на панелях C-E указывают комплексы с более низким и более высоким уровнями олигомеризации соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g005

Как в нативных, так и в разорванных образцах мы обнаружили примерно 15% комплексов, образованных с частицами Dps, меньшими, чем додекамеры (показаны на рис. 5D горизонтальными стрелками).Следовательно, додекамерная форма не является абсолютно необходимой для взаимодействия с ДНК. Фрагментированные ДНК в большинстве случаев содержат молекулы Dps по крайней мере на одном конце двойной спирали. Таким образом, концевое специфическое взаимодействие с Dps не является специфическим свойством коротких линейных фрагментов ДНК. Образцы с разорванной плазмидой содержали в два раза больше комплексов, образованных с кажущимися агрегированными или каким-то образом перестроенными частицами Dps (30 и 15% соответственно), которые обычно были встроены в матрицу ДНК (вертикальные стрелки на рис. 5C – 5E).Хотя их подробная структура требует специального изучения, уже ясно, что этот способ связывания может вызывать значительные конформационные переходы в ДНК, поскольку сверхспиральный стержень, отчетливо видимый около комплекса 3 (рис. 5E), скорее всего, не может образоваться в исходной плазмиде, имеющей прошли обработку никазой и пробоподготовку.

Обсуждение

Dps — основной белок бактериального нуклеоида, конденсирующий геном и защищающий его от различных повреждений во время устойчивого роста и при различных стрессах.Это означает, что взаимодействие с ДНК является фундаментальной биологической функцией этой молекулы. Решающая роль в связывании принадлежит остаткам лизина, расположенным в положениях 5, 8, 10 и 18 двенадцати N-концевых модулей [15]. Их положительный заряд обеспечивает способность связывать отрицательно заряженную ДНК так же, как гистоны в геномах эукариот. Однако, в отличие от октамера гистонов, сферическая поверхность Dps заряжена отрицательно (рис. 6А). Таким образом, остается загадкой, почему эволюция выбрала этот белок для защитного взаимодействия с ДНК.

Распределение заряда на поверхности Dps было рассчитано с использованием Swiss-PdbViewer версии 4.1.0 [52]. На панели [A] порог кулоновской окраски поверхности был установлен на -12 для красного (отрицательный электростатический потенциал), на -1,5 для белого и на 0 для синего (положительный потенциал). В панели [C] масштаб был изменен на: -12, -4,8 и 0 соответственно. N-конец цепи «А» был пропорционально удлинен, чтобы схематично показать расположение Lys ₅ и Lys ₈ (синие шарики).N-концы двух других цепей были удлинены до положения 9 (как в цепи «А»). Серые звездочки в коде [C] обозначают концы гибких модулей. Панель [B] показывает центральную пору и расположение субъединиц около одной и той же вершины. Панель [D] схематически иллюстрирует различные способы взаимодействия, включая связывание с разветвленной ДНК со структурой «соскользнувшая петля» (слева), разорванной ДНК (две правые частицы) и прямой ДНК (вторая справа). В последнем случае два N-конца участвуют в связывании ДНК, а третий из той же вершины может связывать вакантный участок отрицательно заряженного пятна на поверхности другой молекулы Dps.Даже если такие контакты белок-белок могут образовываться в растворе, присутствие ДНК должно стабилизировать их и способствовать агрегации белка. Все размеры молекул на схеме указаны пропорционально натуральным размерам.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0126504.g006

Комплексы с Dps были зарегистрированы для всех типов ДНК, протестированных в этом исследовании, и два новых способа связывания (концевое специфическое связывание и взаимодействие с разветвленной ДНК молекул).Поскольку линейные фрагменты ДНК (рис. 2) или усеченные ДНК (рис. 5) обычно имеют молекулы Dps на конце двойной спирали, мы предполагаем, что специфическое взаимодействие по концам более эффективно, чем связывание Dps с внутренними частями молекул ДНК. Однако искусственные триплексы обгоняли дуплексы в комплексообразовании с Dps (рис. 4, дорожки 1–3), по-видимому, прикрепляя его к внутренней части конструкции (рис. 3). Мы объяснили это предпочтение наличием сайта связывания для дополнительного N-конца в обеих новых мишенях.Поскольку в структуре додекамерных ДНК-связывающих модулей мономеров сгруппированы в триады (рис. 6В), трехстороннее соединение может быть особенно выгодным для образования комплекса, так же, как изогнутые и развернутые ДНК, включая частично расплавленные концы двойной ДНК. спиральные и одноцепочечные разрывы, в то время как взаимодействие с прямой ДНК может быть ограничено всего двумя контактами с N-концом. Если одноцепочечные разрывы являются мишенями для Dps, то уже известная способность этого белка уменьшать их количество в ответ на окислительный стресс [51] может быть опосредована не только физической защитой ДНК, но и его активным участием в связывании с такие дефекты.

Хотя первые 21 аминокислотный остаток в каждой субъединице Dps неструктурированы, 13 из них можно проследить в рентгеновской структуре [16], используя в качестве прототипа полипептидную цепь «A» (обозначенную на фиг. 6B) [16]. Таким образом, ясно, что неструктурированные N-концы довольно длинные и могут участвовать в электростатических взаимодействиях как с отрицательно заряженной ДНК, так и с отрицательно заряженной поверхностью белка. Т.е. они могут прилипать к белку за счет электростатических сил, как это наблюдалось для Dps A . tumefaciens [25] и могут не обнаруживаться в кристаллических структурах либо потому, что они гибкие, как принято считать, либо потому, что их контактные участки случайным образом распределены по всей доступной поверхности. Вот почему способность Dps агрегировать и образовывать олигомерные структуры является его внутренним свойством. Но эта способность в значительной степени стимулируется присутствием ДНК, а бинарные комплексы Dps-ДНК почти никогда не наблюдались в анализах гель-сдвига [1, 14, 19, 34, 39, 49]. Хорошо известно, что основными участниками этого процесса являются те же N-концевые лизины, которые связывают ДНК [15].Таким образом, было высказано предположение, что случайное связывание молекул Dps с ДНК ограничивает их подвижность в пространстве, тем самым увеличивая концентрацию белка в геноме и способствуя межбелковым взаимодействиям [15, 18, 28]. Эта модель очень хорошо объясняет образование крупных агрегатов, часто наблюдаемых с помощью АСМ, но не может объяснить образование высокоупорядоченных двумерных решетчатых массивов [14, 29] и низкую способность свободных Dps агрегировать даже в очень высокой концентрации (см. Рис 2А, например).Наши данные, подчеркивающие важность 3-кратной симметрии, позволили нам предложить другое объяснение сильной зависимости процесса агрегации от присутствия ДНК. Мы предполагаем, что в отсутствие ДНК N-концы Dps не являются полностью свободными. Вместо этого они случайным образом иммобилизуются на отрицательно заряженной поверхности белка. Три сильно заряженных пятна были обнаружены анализом поверхности с помощью Swiss-PdbViewer [52] (рис. 6C). Они расположены на удобном расстоянии от каждого N-конца, обеспечивая идеальную платформу для связывания, что снижает вероятность случайных внешних электростатических контактов.В присутствии ДНК один, два или три ДНК-связывающих модуля каждой вершины могут покинуть свои сайты связывания, освобождая их для контакта с N-концами других молекул Dps, если они расположены на доступном расстоянии. Две левые частицы на рис. 6D иллюстрируют эту ситуацию. То есть, с нашей точки зрения, присутствие ДНК стимулирует белок-белковые связи за счет перераспределения электростатических контактов. Те из них, которые стабилизировали целостность додекамера без ДНК, вызывают агрегацию в новых условиях.

Способность Dps распознавать разветвленную двухцепочечную ДНК может иметь даже большее биологическое значение. В настоящее время известна только одна система в E . coli , который распознает и обрабатывает такие разветвленные структуры, как соединения Холлидея. Эти четырехсторонние соединения образуются во время рекомбинации и репарации ДНК и разрешаются системой, состоящей из трех белков — RuvA, RuvB и RuvC, где октамерная геликаза RuvA специально «скульптурирована» для взаимодействия с крестообразной ДНК [53].Трехсторонние соединения могут быть сформированы в любом сегменте ДНК, содержащем по крайней мере два прямых повтора, где могут быть сформированы два типа структур со скользящими петлями (SLS, проиллюстрированные на рис. 6D) [54]. В бактериальных геномах есть тысячи таких мест, включая кластеры регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR), принадлежащих бактериальной «иммунной» системе и тандемам сайтов связывания факторов транскрипции. В промоторной области гена dps , например, есть четыре пары коротких прямых повторов, две из которых перекрываются с первичным сайтом контакта для Dps (рис. 1B и 1C).Структурное состояние участков генома с тандемными повторами должно находиться под особым контролем клеточных регуляторных систем. Но система, эволюционно адаптированная для этой функции, еще не известна, и бактериальный Dps может быть предложен в качестве кандидата на эту функцию. Его сродство к 3-стороннему соединению и способность вызывать конформационные изменения в ДНК (рис. 1B, 3A и 5E) являются весомыми аргументами в пользу такой возможности. Однако способность Dps к агрегации, которая в основном важна для конденсации генома в стрессовых условиях, может мешать тонкому функционированию, необходимому для управления структурным ландшафтом в активном геноме.

Есть один аспект, который также заслуживает некоторого внимания: если ДНК связана тремя N-концами одной вершины, что считается наиболее сильным способом взаимодействия, центральная пора белковой глобулы ведет во внутреннюю полость (рис. 6С), вплотную приближается к генетическому материалу. Даже небольшая утечка токсичных ионов железа из этой поры может разрушить целостность генома. Таким образом, вероятно, что, защищая ДНК от различных повреждающих агентов и удаляя токсичные ионы железа из геномной среды, Dps также может участвовать в структурно-специфическом разрушении нуклеиновых кислот.

В любом случае наши данные показали, что очищенный Dps E . coli собирается в стабильные додекамерные частицы с некоторым вкладом более мелких олигомеров. Взаимодействуя с ДНК, додекамерная форма Dps продемонстрировала определенную концевую специфичность и высокое сродство к трехстороннему соединению в искусственных молекулах ДНК. Поскольку связывание Dps с ДНК в основном осуществляется за счет электростатических взаимодействий, нет оснований исключать, что Dps также может образовывать комплексы с РНК, влияя на их функциональные свойства или стабильность, тем более что уже сообщалось, что «структуры кораллового рифа», образованные Dps2 М . smegmatis может разрушаться РНКазой А [55]. Таким образом, репертуар многофункционального белка Dps может быть даже шире, чем предполагалось в настоящее время.

Благодарности

Мы хотели бы выразить благодарность Геннадию Енину из Института исследования белков Российской академии наук (РАН) за то, что он поделился с нами своим опытом в АСМ в ходе исследования, и Надежде Зыриной из Института теоретических и экспериментальных исследований. Biophysics, РАН за любезное предоставление Nt.Никаза BspD6I.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: ONO SSA AAT. Проведены эксперименты: VVM USS MNT EVP DVB SSA. Проанализированы данные: ONO SSA AAT VGA. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: ONO SSA VGA. Написал статью: ONO SSA.

Ссылки

1. 1. Азам Т.А., Исихама А. Двенадцать видов нуклеоид-ассоциированного белка из Escherichia coli . Специфичность распознавания последовательностей и аффинность связывания ДНК.J Biol Chem. 1999; 274: 33105–33113. pmid: 10551881
2. 2. Дорман CJ. Связанные с нуклеоидами белки и физиология бактерий. Adv Appl Microb. 2009. 67: 47–64. pmid: 19245936
3. 3. Азам Т.А., Ивата А., Нишимура А., Уэда С., Исихама А. Зависящие от фазы роста изменения в белковом составе нуклеоида Escherichia coli . J Bacteriol. 1999; 181: 6361–6370. pmid: 10515926
4. 4. Гудман С.Д., Фельтен Нью-Джерси, Гао К., Робинсон С., Сегал А.М. In vitro выбор сайтов связывания факторов хозяина интеграции. J Bacteriol. 1999; 181: 3246–3255. pmid: 10322029
5. 5. Чо Б.К., Найт Э.М., Барретт К.Л., Палссон Б.О. Полногеномный анализ связывания Fis в Escherichia coli указывает на причинную роль A- / AT-трактов. Gen Res. 2008. 18: 900–910.
6. 6. Чо Б.К., Барретт К.Л., Найт Е.М., Парк Ю.С., Палссон Б.О. Реконструкция в масштабе генома регуляторной сети Lrp в Escherichia coli .Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105: 19462–19467. pmid: 135
7. 7. Bouffartiques E, Buckle M, Badaut C, Travers A, Rimsky S. Кооперативное связывание H-NS с высокоаффинными сайтами в регуляторном элементе приводит к подавлению транскрипции. Nat Struct Mol Biol. 2007. 14: 441–448. pmid: 17435766
8. 8. Ueguchi C, Kakeda M, Yamada H, Mizumo T Аналог молекулярного шаперона DnaJ в Escherichia coli . Proc Nati Acad Sci USA. 1994; 91: 1054–1058.pmid: 8302830
9. 9. Bloch V, Yang Y, Margeat E, Chavanieu A, Auge MT, Robert B et al. Домен димеризации H-NS определяет новую складку, способствующую распознаванию ДНК. Nat Struct Mol Biol. 2003; 10: 212–218.
10. 10. Зонненфилд Дж. М., Бернс К. М., Хиггинс К. Ф., Хинтон Дж. К. Д. Связанный с нуклеоидом белок StpA связывает изогнутую ДНК, имеет большую аффинность связывания ДНК, чем H-NS, и присутствует в значительных количествах у мутантов hns . Биохимия. 2001; 83: 243–249.pmid: 11278075
11. 11. Боннефой Э, Такахаши М, Янив Ю.Р. Параметры связывания ДНК белка HU Escherichia coli с крестообразной ДНК. J Mol Biol. 1994; 242: 116–129. pmid: 8089835
12. 12. Castaing B, Zelwer C, Laval J, Boiteux S. Белок HU Escherichia coli специфически связывается с ДНК, которая содержит одноцепочечные разрывы или разрывы. J Biol Chem. 1995; 270: 10291–10296. pmid: 7730334
13. 13. Lavoie BD, Shaw GS, Millner A, Chaconas G.Анатомия комплекса флексер – ДНК внутри промежуточного соединения транспозиции более высокого порядка. Клетка. 1996; 85: 761–771. pmid: 8646783
14. 14. Альмирон М.А., Линк Дж., Ферлонг Д., Колтер Р. Новый ДНК-связывающий белок с регуляторными и защитными функциями в голодной Escherichia coli . Genes Dev. 1992; 6: 2646–2654. pmid: 1340475
15. 15. Ceci P, Cellai S, Falvo E, Rivetti C, Rossi GL, Chiancone E. Конденсация ДНК и самоагрегация Escherichia coli Dps — это связанные явления, связанные со свойствами N-конца.Nucl Acids Res. 2004. 32: 5935–5944. pmid: 15534364
16. 16. Грант Р.А., Фильм Диджей, Финкель С.Е., Колтер Р., Хогл Дж. М.. Кристаллическая структура Dps, гомолога ферритина, который связывает и защищает ДНК. Nat Struct Biol. 1998. 5: 294–303. pmid: 9546221
17. 17. Де лос Риос С., Перона Дж. Дж. Структура Escherichia coli Лейцин-чувствительный регуляторный белок Lrp обнаруживает новую октамерную сборку. J Mol Biol. 2007; 366: 1589–1602. pmid: 17223133
18. 18.Сеси П., Илари А., Фалво Е., Джангиакомо Л., Чианконе Е. Повторная оценка стабильности белка, связывания ДНК и защиты Mycobacterium smegmatis Dps. J Biol Chem. 2005; 280: 34776–34785. pmid: 16030020
19. 19. Рой С., Сарасвати Р., Чаттерджи Д., Виджаян М. Структурные исследования второго Mycobacterium smegmatis Dps: неизменные и изменчивые особенности структуры, сборки и функции. J Mol Biol. 2008; 375: 948–959. Доступно: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17543333. pmid: 18061613
20. 20. Юань Х.С., Финкель С.Е., Фенг Я.А., Качор-Гжесковяк М., Джонсон Р.С., Дикерсон Р.Э. Молекулярная структура белка FIS дикого типа и мутантного белка FIS: взаимосвязь между мутационными изменениями и функцией рекомбинационного энхансера или связыванием ДНК. Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88: 9558–9562. pmid: 1946369
21. 21. Кавамура Т., Вартанян А.С., Чжоу Х., Далквист Ф.В. Дизайн участвует в регуляции PapI и Lrp оперона pap.J Mol Biol. 2011; 409: 311–332. pmid: 21338611
22. 22. Cordeiro TN, Schmidt H, Madrid C, Juarez A, Bernado P, Griesinger C. et al. Непрямое считывание ДНК белком, родственным H-NS: структура комплекса ДНК С-концевого домена Ler. Путь PLoS. 2011; 7: e1002380.
23. 23. Райс ПА, Ян С.В., Мидзуучи К., Нэш Х.А. Кристаллическая структура комплекса ИГФ-ДНК: разворот ДНК, индуцированный белком. Клетка. 1996. 87: 1295–1306. pmid: 8980235
24. 24. Стелла S, Cascio D, Johnson RC.Форма малой бороздки ДНК управляет связыванием ДНК-изгибающего белка Fis. Gen Dev. 2010; 24: 814–826.
25. 25. Сеси П., Илари А., Фалво Е., Чианконе Е. Белок Dps Agrobacterium tumefaciens не связывается с ДНК, но защищает ее от окислительного расщепления: кристаллическая структура рентгеновского излучения, связывание железа и свойства улавливания гидроксильных радикалов. J Biol Chem. 2003; 278: 20319–20326. pmid: 12660233
26. 26. Стиллман Т.Дж., Упадхьяй М., Норте В.А., Седельникова С.Е., Каррадус М., Цоков С.и другие. Кристаллические структуры белков Dps Lactococcus lactis MG1363 показывают присутствие N-концевой спирали, которая необходима для связывания ДНК. Mol Microbiol. 2005; 57: 1101–1112. pmid: 160
27. 27. Чианконе Э., Сеси П. Многогранная способность белков Dps бороться с бактериальными стрессовыми состояниями: детоксикация железа и перекиси водорода и связывание ДНК. Biochim Biophys Acta. 2010; 1800: 798–805. pmid: 20138126
28. 28. Ceci P, Mangiarotti L, Rivetti C, Chiancone E.Активирующий нейтрофилы белок Dps Helicobacter pylori , HP-NAP, использует механизм, отличный от Escherichia coli Dps, для связывания и конденсации ДНК. Nucl Acids Res. 2007. 35: 2247–2256. pmid: 17371778
29. 29. Гупта С., Чаттерджи Д. Бимодальная защита ДНК с помощью ДНК-связывающего белка Mycobacterium smegmatis из клеток стационарной фазы. J Biol Chem. 2003. 278: 5235–5241. pmid: 12466274
30. 30. Вольф С.Г., Френкиль Д., Арад Т., Финкель С.Е., Кольтер Р., Мински А.Защита ДНК путем биокристаллизации, вызванной стрессом. Природа. 1999; 400: 83–85. pmid: 10403254
31. 31. Frenkiel-Krispin D, Levin-Zaidman S, Shimoni E, Wolf SG, Wachtel EJ, Arad T. et al. Регулируемые фазовые переходы бактериального хроматина: неферментативный путь для общей защиты ДНК. EMBO J. 2001; 20: 1184–1191. pmid: 11230141
32. 32. Френкиль-Криспин Д., Бен-Аврахам И., Энгландер Дж., Шимони Э., Вольф С. Г., Мински А. Реструктуризация нуклеоидов у бактерий в стационарном состоянии.Mol Microbiol. 2004. 51: 395–405. pmid: 14756781
33. 33. Азам Т.А., Хирага С., Исихама А. Два типа локализации ДНК-связывающих белков в нуклеоиде Escherichia coli . Гены Клетки. 2000. 5: 613–626. pmid: 10947847
34. 34. Френкиль-Криспин Д., Мински А. Нуклеоидная организация и поддержание целостности ДНК в E . coli , B . subtilis и D . радиодуранс .J. Struct Biol. 2006; 156: 311–319. pmid: 16935006
35. 35. Huergo LF, Rahman H, Ibrahimovic A, Day CJ, Korolika V. Campylobacter jejuni Белок Dps связывает ДНК в присутствии железа или перекиси водорода. J Bacteriol. 2013; 195: 1970–1978. pmid: 23435977
36. 36. Зет К. Биоминерализующие белки Dps: многофункциональные архитекторы природы. Биохим Дж. 2012; 445: 297–311. pmid: 22788214
37. 37. Salgado H, Peralta-Gil M, Gama-Castro S, Santos-Zavaleta A, Muñiz-Rascado L, García-Sotelo JS.и другие. RegulonDB v8.0: наборы данных omics, эволюционное сохранение, нормативные фразы, перекрестно проверенные золотые стандарты и многое другое. Nucl Acids Res. 2013; 41 (выпуск базы данных): D203–213. pmid: 23203884
38. 38. Calhoun LN, Kim JN, Ren Y, Song JJ, Kwon YM. ДНК-связывающий белок Dps функционирует как глобальный регулятор при голодании Salmonella enterica сероварном энтеридите во время голодания. Int J Microb Res. 2011; 3: 136–147. http://dx.doi.org/10.9735/0975-5276.3.3.136-147.
39. 39.Пуртов Ю.А., Глазунова О.А., Антипов С.С., Покусаева В.О., Фесенко Е.Е., Преображенская Е.В. и другие. Промоторные острова как платформа для взаимодействия с нуклеоидными белками и факторами транскрипции. J Bioinform Comput Biol. 2014; 12: 1441006. pmid: 24712533 ​​
40. 40. Ilari A, Ceci P, Ferrari D, Rossi GL, Chiancone E. Включение железа в Escherichia coli Dps дает ферритиноподобное микрокристаллическое ядро. J Biol Chem. 2002; 277: 37619–37623. pmid: 12163499
41. 41.Ивахори К., Эномото Т., Фурушо Х., Миура А., Нишио К., Мисима Ю. и др. Синтез наночастиц сульфида кадмия в белке Dps из Listeria innocua . Chem Mater. 2007. 19: 3105–3111.
42. 42. Игараси К., Исихама А. Двудольная функциональная карта E . coli альфа-субъединица РНК-полимеразы: участие С-концевой области в активации транскрипции с помощью цАМФ-CRP. Клетка. 1991; 65: 1015–1022. pmid: 1646077
43. 43. Тутукина М.Н., Шавкунов К.С., Масулис И.С., Озолин О.Н.Антисмысловая транскрипция в локусе hns Escherichia coli . Мол Биол (Моск). 2010. 44: 439–447. pmid: 20608167
44. 44. Маниатис Т., Фриш Э. Ф., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. Нажмите; 1982.
45. 45. Рогулин Е.А., Перевязова Т.А., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Плазмида pRARE как вектор для клонирования с целью конструирования суперпродуцента сайт-специфической никазы N.BspD6I.Биохимия (Москва). 2004. 69: 1123–1127. pmid: 15527412
46. 46. Антипов С.С., Покусаева В.О., Мелехов В.В., Озолин О.Н. Зависимость образования нуклеопротеидных комплексов с белком Dps от физико-химических свойств ДНК. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2013; 7: 24–28. Доступно: http://www.radiotec.ru/catalog.php?cat=jr19&art=13161
47. 47. Altuvia S, Almiron M, Huisman G, Kolter R, Storz G. Промотор dps активируется OxyR во время роста и IHF и σ ^S в стационарной фазе.Mol Microbiol. 1994; 13: 265–272. pmid: 7984106
48. 48. Lacour S, Landini P. Экспрессия SigmaS-зависимых генов в начале стационарной фазы в Escherichia coli : функция sigmaS-зависимых генов и идентификация их промоторных последовательностей. J Bacteriol. 2004; 186: 7186–7195. pmid: 15489429
49. 49. Швырева У.С., Тутукина М.Н., Озолин О.Н. Бактериоферритин: свойства, структурная и функциональная организация регуляторной области гена dps .Биофизика. 2011; 56: 795–802.
50. 50. Мачулин А.В., Дерюшева В.И., Юнусова А.К., Железная Л.А., Сердюк И.Н. Исследование сайт-специфического связывания ДНК с никелирующей эндонуклеазой Nt.BspD6I на уровне отдельной молекулы с помощью атомно-силовой микроскопии. Биофизика. 2012; 57: 314–317.
51. 51. Мартинес А., Колтер Р. Защита ДНК во время окислительного стресса с помощью неспецифического ДНК-связывающего белка Dps. J Bacteriol. 1997; 179: 5188–5194. Доступно: http://jb.asm.org/content/179/16/5188.full.pdf + html. pmid: 9260963
52. 52. Guex N, Peitsch MC. SWISS-MODEL и Swiss-PdbViewer: среда для сравнительного моделирования белков. Электрофорез. 1997; 18: 2714–2723. pmid: 9504803
53. 53. Инглстон С.М., Дикман М.Дж., Грасби Д.А., Хорнби Д.П., Шарплс Г.Дж., Ллойд Р.Г. Связывание узлов Холлидея и процессинг белком RuvA Mycoplasma pneumoniae . Eur J Biochem. 2002; 269: 1525–1533. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11874468.pmid: 11874468
54. 54. Хомякова Е.Б., Петрова М.В., Минят Э.Е., Иванов В.И. Структура ДНК со скользящей петлей: конкретная нуклеотидная последовательность образует только один уникальный конформер. Письма FEBS. 1998. 422: 265–268. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/94. pmid: 94
55. 55. Гхатак П., Кармакар К., Касетти С., Чаттерджи Д. Раскрытие роли Dps в организации микобактериальных нуклеоидов. PLoS ONE. 2011; 6: e16019. pmid: 21283627

способов взаимодействия Escherichia coli Dps с ДНК по данным атомно-силовой микроскопии

PLoS One.2015; 10 (5): e0126504.