Лена Тюрина, Казань, Россия, ВКонтакте, 33 лет, id23199540
Я хочу…
Все мы немного мечтаем. Кто-то тихо про себя, а кто-то — во всеуслышание. Не стесняйтесь своих желаний, рассказывайте о них, быть может, кто-нибудь поможет Вам их осуществить…
Наука и Факты
Входим в топ-3 познавательных сообществ ВК.
MDK
Речной порт «Казань»
Добро пожаловать в сообщество посвященное речному транспорту Казани. Расписание и тарифы — vk.cc/atBC36
Ваши вопросы — vk.me/port_kazan Льготы — vk.cc/6KlYKd
Возврат билетов — vk.cc/6KlZnF Выбор круизов:
Инфофлот — vk.cc/2ssSHN
Спутник-Гермес — vk.cc/2CNEeA
ВодоходЪ — vk.cc/2siLY4
Волжские путешествия — vk.cc/2siMZ1
ВолгаПлёс — vk.cc/2CNHiv
Все для девушек: мода, стиль, красота, секреты звезд, советы, лайфхаки, новости шоубизнеса и еще много интересного😍🥰
Style and Decor
Для любителей красоты, стиля и благоустройства. Все о ремонте, полезные идеи, лайфхаки, современные тенденции, новые веяния😍
Интерьер и декор — новый взгляд на дизайн вашей квартиры. Тысячи фотографий интерьеров, предметов дизайна и свежих идей, а также профессиональные статьи о мире дизайна. Мы делимся с вами советами и предложениями по обустройству дома, чтобы Вы без труда смогли создать уютную жилую зону Вашей мечты!
Пошлые
До тех пор, пока пошлость будет собирать толпы поклонников, её создателям не будет стыдно за то, что они делают.
Мамины заметки
— Идеи для творчества с детками
— Советы по воспитанию
— Полезные статьи о здоровье детей
— Возможность задать вопрос другим мамочкам в сообщениях группы!
Более 1 000 000 мам доверяют нам уже более 7 лет! Спасибо!
Её сознание
Обсуждаем, спорим, шутим в комментариях на самые шумные темы
Самые интересные, необычные, странные и удивительные новости со всего мира. Факты, юмор, фото, знаменитости.
Шпильки | Женский Журнал
С нами вы узнаете о всех секретах женской красоты, а также о:
⭐Лучших идеях макияжа, маникюра и причесок
⭐Самых последних новинках моды
⭐Трендах
⭐Уходе за волосами, лицом и телом
⭐Новостях любимых звезд
⭐Историях из жизни женщин и многое другое! Рады вас видеть, будет интересно!
Может обсудим?
Мы собираем самые жгучие и горячие новости, что бы ты мог обсудить в комментариях 😏😏
——-
Весь материал отобран с сети VK и переработан вручную.
Не повторяйте такое
Одно из лучших сообществ в сети, которое поднимет вам настроение. Подписывайся и рассказывай друзьям!
ВСЁ, что ВЫ хотели бы знать о путешествиях!
Верую † Православие
Дорогие друзья!
Мы от всей души благодарим всех участников и Администраторов других православных групп, которые делают перепост наших новостей на своих страницах и в пабликах. Спасибо, что цените наш труд, спасибо, что бескорыстно помогаете в развитии группы «Верую † Православие», спасибо за тёплые слова поддержки, которые часто оставляете в комментариях. Пусть ваше добро вернётся к вам сторицей.
Лучшая благодарность за нашу работу – «рассказать друзьям» о сообщениях, которые вам понравились.
Мира вам, радости, и помощи Божией во всех начинаниях.
Работа в Казани
Sweet Wedding | Сладкая Свадьба
Красивые отношения бывают один раз, запоминаются на всю жизнь и эти отношения приводят к свадьбе 💍
Лена Тюрина и Валерий Феоктистов
Вернувшись домой, Валерий застал дома Аленку. Часы показывали половину одиннадцатого утра, и вернуться из школы так рано дочь никак не могла.
– Почему не на учебе? – спросил подполковник, заходя в комнату к дочери.
– Прогуливаю, – как ни в чем не бывало ответила Аленка.
– Что значит «прогуливаю»?! – строго спросил Валерий.
Должность отца двенадцатилетней Аленки была не менее ответственна, чем командование штурмовой группой антитеррора. И здесь, как и в подразделении, нужно было быть строгим, но тактичным и справедливым.
– Папка, что ты такой сердитый с утра? – Аленка, как и всегда в таких случаях, применила запрещенный прием, повисла на отцовской шее.
– Все‑таки объясни, что со школой? – более мягким тоном произнес Феоктистов.
– К сожалению, не взорвалась, – ответила дочь.
– А что, должна была? – Валерий окончательно перешел на шутливый тон.
– Должна, – вздохнула девочка с заметным сожалением, – Утром кто‑то позвонил и сказал, что в школе заложено ВУ.
– Что заложено? – аж присвистнул Валерий.
– ВУ – взрывное устройство. Так нам классная руководительница объяснила. Приехали собачка и милиционеры, и еще какая‑то оранжевая машина, а в ней дяденьки в камуфляже.
«Апельсин – спецмашина взрывотехников, – сразу же сообразил Ротмистр. – И подчиненные Гриши Гурьева. Значит, что‑то серьезное…»
– Нашли? – сдерживая волнение, спросил он дочку.
– Да, собачка по запаху нашла бомбу в девчачьем туалете на третьем этаже. Но бомба оказалась не настоящей. Кто‑то пошутил.
– И кто, как ты думаешь? – поинтересовался Валерий.
– Не знаю, – пожала тонкими плечиками Аленка. – Тетенька‑милиционер спросила у директора, в каких классах сегодня были намечены контрольные. Директор сказал, что в 6‑м Б и в 9‑м А. Эти два класса оставили в школе, а остальных отпустили по домам.
– Здорово, – только и произнес подполковник. – Но у тебя ведь, кажется, сегодня танцы?
– Папа! Не танцы, а хореография! – Строгие интонации на сей раз были в Аленкином голосе.
«И в самом деле! – мысленно ругнул себя Валерий. – Танцы в кабаке. А у Аленки – искусство».
Валерия радовало то, что дочь занимается в хореографической студии районного дома творчества. Правда, последнее время Аленка настаивала, чтобы ей позволили заниматься еще и рукопашным боем. Такая секция тоже имелась в доме творчества. В отличие от супруги Валентины, Феоктистов был категорически против.
– Девочка и РБ[2]? Ужасно! До четырнадцати лет никаких рукопашных, – твердо заявил Валерий.
– Ничего плохого не будет, если Алена научится постоять за себя, – возражала Валентина.
– Девочки драться не должны. Ну, вспомни себя в детстве! – не соглашался с женой подполковник.
– Ну, тогда… было другое время, – отвечала Валентина. – И, кстати говоря, меня иногда в детстве обижали и колотили, и если бы я…
– Если бы ты занималась РБ, мы вряд ли поженились, – покачал головой Валерий. – Ты бы стала грубой, мужеподобной. Плечи у тебя вот так бы расширились! – Феоктистов вытянул свои боксерские ручищи. – А бедра, наоборот, сузились, – и он вновь показал, насколько сузились бы Валентинины бедра.
Супруга фыркнула, но ничего не сказала. По счастью, у Валентины все было как раз наоборот.
– После четырнадцати делайте, что хотите, – вынес окончательный вердикт Валерий.
– Девочка так хочет записаться в секцию, – не унималась Валентина. – И тренер там вежливый, тактичный.
– Тренер неплохой, я его знаю, – кивнул подполковник. – Дело не в этом. Если серьезно заниматься РБ, то это постоянные удары в голову. Нужно это девчонке?! И не только в голову, а… извини меня, и по интимным местам. А ей ведь рожать когда‑нибудь придется. Ну, а несерьезные занятия пустая трата времени. Танцы другое дело.
– Не танцы, а хореография! – в очередной раз поправила Валерия жена.
Но и «танцы» вызывали у Феоктистова некоторые сомнения. Как и большинство девчонок ее возраста, Аленка мечтала связать дальнейшую жизнь именно с хореографией. И это несколько тревожило и Валерия, и Валентину. Нет, у девочки были прекрасные физические данные – она была легкой, тоненькой, но при этом выносливой и быстрой. Одно смущало и родителей, и педагогов. Внешне Аленка была симпатичной, но уж слишком веснушчато‑конопатой, вся в деда по материнской линии. Веснушки не портили ее милого, кареглазого (в Феоктистова) лица, но для сценической карьеры могли стать серьезным препятствием… Впрочем, Аленке лишь на прошлой неделе исполнилось двенадцать, и пока еще было рано думать о выборе профессии.
– Пап, ты обедать будешь? – раздался из кухни Аленкин голосок.
– Буду, – ответил Валерий, не без гордости отметив, что дочери нравится быть маленькой хозяйкой.
Аленка сказала еще что‑то, но в этот момент у Феоктистова зазвонил мобильник.
Наркотрест. Поглощение мелких предприятий более крупными. Устранение конкурентов… Производить и сбывать господин Дранковский способен лишь одно – смерть. В данном случае – «белую», наркотики. Россия для него всего лишь большой «рынок сбыта». «Овладеть» им так, чтобы стать безоговорочным монополистом, не так уж просто. Слишком много других желающих. Для осуществления такого плана Дранковскому и в самом деле были необходимы амулеты. Вот только откуда он узнал об их чудодейственной силе?! Значит, она, эта сила, и в самом деле есть в Черепе, Еже и Клыках?! Об этом ведал лишь один человек, который был сейчас очень далеко…
Лена почувствовала, как на ее глаза наворачиваются слезы. Прочь, прочь посторонние мысли! Взять себя в руки! Вот так, никаких мокрых глаз. А теперь берем мобильный телефон и набираем номер Ротмистра. Феоктистов отозвался после первого же гудка‑сигнала.
– База отдыха «Будь здоров»? – переспросил, выслушав Лену, подполковник.
– Раньше принадлежала НИИ измерительных приборов, – уточнила она.
– Байдарочники, яхтсмены… – произнес Феоктистов. – Встретимся через час.
Подполковник не имел обыкновения откладывать дела в долгий ящик. Встретиться они условились у железнодорожной станции по Истринскому направлению.
Феоктистов появился перед Леной ровно через час и три минуты все на том же видавшим виды «Опеле».
– Что ж, если все так и окажется, предлагаю следующее, – проговорил Ротмистр, внимательно выслушав подробный рассказ Лены. – Сперва проводим разведку. Если в этом «будьздорове» и в самом деле имеются граждане, похожие на боевиков, я вызываю сюда пару наших боевых отделений. Ставим базу на «уши», а там по обстановке.
– Теракт намечен на следующую неделю, – сказала в ответ Лена. – Если на турбазе располагается основная группа, то акция будет сорвана. А если нет?
– В каком смысле? – спросил Феоктистов.
– База – это так. Дополнительное место дислокация. ЛЗКП[3], одним словом. Там может быть некоторая часть оружия, но основные силы находятся в другом месте.
– ЛЗКП? – переспросил Валерий, оценив знание специальной терминологии.
Перед ним в самом деле был серьезный профессионал. Лишнего не сболтнет… Между тем сейчас впереди была база «Будь здоров!» и ничего более.
– Значит, если мы возьмем штурмом ЛЗКП, то… Что предпримет, по‑твоему, основная группа? – продолжил «военный совет» Феоктистов.
– Акция начнется без малейшего промедления. Они ведь давно выбрали цель, подготовились. Штурм ЛЗКП спровоцирует террористов.
– Возможно, – согласился с Леной подполковник.
В самом деле, террористы могут рассредоточиться, отступить. Но могут и немедленно перейти к активным действиям. Это означало неминуемые жертвы, кровь… И ведь цель их наверняка дети.
– Здесь есть пионерские лагеря? – спросил Валерий.
– Их уже лет пятнадцать как ликвидировали по всей стране, господин Ротмистр, – Лена неожиданно позволила себе едкую иронию. – В восьми километрах от предполагаемой базы скаутский лагерь. Те же пионеры, только галстуки синие с желтым.
– Учебный год еще не закончился, – махнул рукой Валерий, вспомнив разговор с Аленкой.
В самом деле, до лагерного сезона оставалось еще целых три недели.
– В скаутском лагере детишки отдыхают с пятницы до воскресного вечера, – вновь проявила знание обстановки Елена. – Их из Москвы привозят на автобусе.
– Стало быть, пора увидеть этот «Будь здоров!», далее действовать по обстановке, – подвел итог «военного совета» Феоктистов.
Двое крепких ребят в спортивных костюмах беззаботно курили, о чем‑то неторопливо беседуя.
– Откуда такая оптика? – поинтересовался Валерий, не отрывая глаз от бинокля.
– Трофейный, – ответила Лена.
Оптика была что надо. Призменный шестиугольный бинокль был шестикратного увеличения, вид имел компактный, и по весу был намного легче армейского полевого бинокля. Обрезиненный корпус надежно защищал оптику от ударов и повреждений.
– Байдарочники, – произнес Валерий, передавая бинокль Лене. – Никаких признаков террористической опасности.
Лена и Феоктистов наблюдали территорию бывшей турбазы НИИ «Точприбор» уже более часа. Они выбрали очень удобную наблюдательную позицию на противоположном от «будьздорова» берегу Истринского водохранилища. Место было глухое, берег илистым – лучшее место для наблюдателя трудно было даже вообразить. По территории турбазы передвигались спортивного вида мужики, и не более того. Оружия, боеприпасов, вообще чего‑либо боевого не наблюдалось. Не наблюдалось также женщин, детей и собак. Последнее и насторожило Ротмистра.
– Одинокие спортсмены‑любители. Всем примерно тридцать лет, ни одного пенсионера… Кто они? – спросил Феоктистов Лену.
– Обрати внимание, – в свою очередь заметила женщина, – совершенно непонятно, каким видом спорта они занимаются. У воды не видно сушащихся весел, лодок.
– Мы видим только часть территории, – покачал головой Валерий. – Эти ребята – кавказцы?
– Не сказала бы. Но и на русских не сильно похожи. Точнее, больше похожи на русских. Похожи, но не более.
Некоторое время Ротмистр и Лена сидели молча. Нет, не байдарочники оккупировали точприборный «будьздоров».
– Пора бы и послушать их, – нарушила молчание Лена, достав из своей спортивной сумки небольшой прямоугольный прибор с наушниками. – Вот только придется подождать темноты, – вздохнула она.
Ротмистр посмотрел на часы. Ждать им еще надо было не менее двух‑трех часов.
«Завтра придется опоздать на построение и утренний инструктаж, – мысленно сказал себе Феоктистов. – Пожалуй, впервые за пятнадцать с лишним лет службы в „Альфе“.»
Лена Тюрина (Конечная), Россия, Шенкурск
Биография Лены
Лена Тюрина проживает в городе Шенкурск, Россия. Родной город — Шенкурск. Девичья фамилия (фамилия до вступления в брак) — Конечная. Семейное положение Лены: замужем. Знак зодиака Рыбы. Из открытых источников получены следующие сведения: информация о высшем и среднем образовании.
Страна: | Россия |
Город: | Шенкурск |
Место рождения: | Шенкурск |
Девичья фамилия: | Конечная |
Возраст: | нет данных |
Дата рождения: | 2 марта |
Знак зодиака: | Рыбы |
Семейное положение: | состоит в браке |
Место жительства
Среднее образование
Шенкурская средняя школа начало обучения с 1979г. — выпуск 1987г. | Россия, Шенкурск |
Коммерческо-экономический техникум (ВКЭТ, ВЭТ, бывш. ВУЭТ) начало обучения с 1987г. — выпуск 1990г. | Россия, Вельск |
Высшее образование
СГА, дата окончания: 2013 Факультет: Экономика Кафедра: Экономики Статус: Выпускница (бакалавр), Заочное отделение | Россия, Москва |
Социальные сети
нет данных | |
нет данных | |
нет данных | |
ВКонтакте | id170550708 |
Одноклассники | нет данных |
Мой Мир@Mail.ru | нет данных |
Источник информации
Информация получена из общедоступного открытого источника.
За достоверность информации сайт ответственность не несет.
Если это ваша анкета, то вы можете ее удалить. Перейти к удалению анкеты
Лена Тюрина ВКонтакте, Брест, Беларусь, id146612828
ВестнИк ЗОЖ
ВестнИк ЗОЖ. Рецепты народной медицины, а так же любые другие советы медицинского характера, размещенные в группе, опубликованы только для ознакомления, их запрещено применять без консультации с врачом.
Здоровая Кухня — рецепты / правильное питание
Верую † Православие
Дорогие друзья!
Мы от всей души благодарим всех участников и Администраторов других православных групп, которые делают перепост наших новостей на своих страницах и в пабликах. Спасибо, что цените наш труд, спасибо, что бескорыстно помогаете в развитии группы «Верую † Православие», спасибо за тёплые слова поддержки, которые часто оставляете в комментариях. Пусть ваше добро вернётся к вам сторицей.
Лучшая благодарность за нашу работу – «рассказать друзьям» о сообщениях, которые вам понравились.
Мира вам, радости, и помощи Божией во всех начинаниях.
Сама Себе Тренер
ДЕТИ В СЧАСТЛИВОЙ СЕМЬЕ † Православие
В настоящее время желающие благочестиво жить окружены всякими неудобствами и затруднениями. Особенно трудно воспитывать детей в духе христианском и в правилах святой Православной Церкви. Братья и сестры, давайте же, не стыдясь и не боясь мира, постараемся дать детям истинное христианское воспитание, приучая их к христианским правилам жизни и возгревая любовь к Господу и людям. Если будем жить во взаимной любви, низведём на себя и своё потомство Божью благодать — и Бог вселится в нас и увенчает все начинания и дела наши благословенным успехом, ибо где любовь, там Бог, а где Бог, там все доброе. ——-
Сообщество существует по благословению прот. Романа Барановского, настоятеля Храма свт. Михаила, первого митрополита Киевского, г. Киев. УПЦ МП
____
Любые ссылки и нецензурные выражения в комментариях к постам автоматически удаляются фильтром.
Храм Тихвинской иконы Божией Матери в г. Бресте
Московский Патриархат
Белорусская Православная Церковь
Брестская епархия
г. Брест ул. Волгоградская, 23
*Православная невеста и жена*
«И сказал Господь Бог: “Нехорошо быть человеку одному; сотворим ему помощника, соответственного ему“ (Быт. 2:18). В книге Иеремии 31:22 записано: «…Господь сотворит на земле нечто новое: жена спасет мужа». Один из переводов означает следующее: «Женщина ограждает мужчину». Что это означает? Бог поручил женщине ограждать мужчину от пустой и напрасной траты сил, чтобы в борьбе с жизненными невзгодами он не принес себя в жертву второстепенным делам, а твёрдо держался фундамента, на котором он должен устроить жизнь и внести вклад в общую задачу, выполняемую человечеством. «Кто найдет добродетельную жену? цена ее выше жемчугов» (Притчи 31:10) Строить дом и семью — в этом истинное призвание женщины и залог благополучия общества и государства. В Православии накоплен богатейший опыт построения и созидания христианской семьи. Здесь мы постараемся обобщить эти знания.
Мы — поколение ЗОЖ. Здоровым быть модно!
Важно: вся информация, представленная в сообществе «Мы — поколение ЗОЖ. Здоровым быть модно!», носит исключительно ИНФОРМАЦИОННЫЙ характер и не заменяет консультацию, диагноз или профессиональное медицинское обслуживание. При возникновении проблем со здоровьем немедленно обратитесь к профильному специалисту. 1. Паблик открыт для всех, кроме тех, кто забанен. 2. У нас свободная страна, каждый высказывает своё мнение в свободной форме, если это не оскорбление других участников.
Если Вас ЛИЧНО оскорбляют, то НЕ ОСКОРБЛЯЙТЕ В ОТВЕТ, а пишите админу и прикладывайте скрин комментариев с оскорблениями и ссылку на пост.
— За мат и/или адресные оскорбления — бан.
— За сообщения не по теме — бан.
Пожалуйста, относитесь к друг другу с уважением и пониманием. 3. В комментариях запрещено: размещать рекламу (в т.ч., скрытую), название иных пабликов или сайтов, ссылки на сторонние сайты/группы/паблики/страницы/посты без уведомления и разрешения админов. За нарушение этого пункта — бан!
За скрытую рекламу может приниматься любой призыв обратиться в лс для покупки чего-либо, показ своей продукции в комментариях или предложение каких-либо услуг. 4. Если возник вопрос к админам, не пишите всем админам одновременно! За это — бан. Пишите только одному! Не размещаем рекламные такие рекламные посты : Эротика
Всё что связанно с сексом (даже если это замаскировано словами другими)
Шок фото
Шок посты
Посты про половые органы
Посты про менструацию, прокладки
Посты вызывающие отвращение
Никаких слов: секс, наркотик, шок
Никаких намеков на то что тема секса будет раскрыта по ссылке
Казино
Ставки на спорт
Таро и гадание
Алкоголь
Сигареты
Посты обещающие похудеть за какой-то срок
Посты которые не нравятся админу
Свято-Успенский Жировичский монастырь
Свято-Успенский Жировичский монастырь — мужской ставропигиальный монастырь Белорусской Православной Церкви, расположенный в агрогородке Жировичи Слонимского района Гродненской области. Один из главных центров белорусского Православия и крупнейших в стране архитектурных ансамблей XVII—XVIII веков. КОНТАКТЫ
Паломнический отдел: +375 1562-39-410 +375 29 1717561 +375 29 8869171
Бухгалтерия: +375 1562-51-243
Дежурный по монастырю: +375 1562-51-245
Кулинарная ШКОЛА. Сахарини. г. Брест.
Студия «Сахарини» обучает детей и взрослых кулинарному мастерству.
Мы отправляемся в гастрономические путешествие в разные страну — учимся готовить разные национальные блюда и десерты. Кроме этого, у нас много разных вкусных уроков по декору, выпечке и лепке сладких шедевров.
Подготовка к чемпионатам!
Архимандрит Иоанн Крестьянкин. Старцы
Группа посвящена уникальному явлению русской духовной культуры: православному старчеству. Здесь вы найдёте: высказывания, поучения и советы: псково-печерских, саровских, валаамских. киевских, радонежских, афонских, соловецких, оптинских, глинских, одесских, белгородских и прочих старцев.
Лена Тюрина, 28 лет — полная информация о человеке из профиля (id3726289) в социальных сетях (ВКонтакте)
Лена Тюрина
Информации о личной жизни Лены не найдено
Пользователь решил не оставлять личного статуса на своей страничке.
Фотографии
Можно листать свайпом, увеличивать по клику
Основная информация о Тюриной Лене
Имя
Лена
Фамилия
Тюрина
Девичья фамилия
Не указана
Пол
Женщина
День рождения
28
Месяц рождения
ноябрь
Год рождения
1992
Дата рождения
28.11.1992
Полных лет
28
Кто по гороскопу
Стрелец
Страна
Россия
Родной город
Ярославль
Город проживания
Не указан
Электронная почта (email)
Скрыто
Номер телефона
Известен, но скрыт
Владение языками
Скрыто или не заполнено
Контакты, ссылки
Facebook
Не указан
Twitter
Не указан
Instagram
Не указан
LiveJournal
Не указан
Skype
Не указан
VK ссылка
id3726289
Личный сайт
Не указан
Основная информация о её VK профиле
Галочка верификации
Отсутствует
Дата регистрации профиля ВКонтакте
20 ноября 2007 года
Прошло после регистрации
13 лет 8 месяцев 11 дней
Онлайн ли сейчас
Нет
Когда была онлайн
01 августа 2021 в 05:29:02
С какого устройства заходила
С компьютера
ID профиля
3726289
Никнейм (псевдоним)
Короткий адрес страницы (домен, никнейм) не задан
Настройки приватности страницы Лены
Наполнение страницы
Сколько подписчиков
396
Сколько друзей
187
Подарки
Нет данных
Заметки
Нет данных
Фотоальбомы
1
Фотографии
100
Видеозаписи
24
Аудиозаписи
1581
Группы
Скрыто
Паблики
43
Где училась и работала
Школа
Школа № 37’10
2000—2010
Класс: а
,
ВУЗ
ЯрГУ им. П. Г. Демидова’15
Экономический факультет
Бухгалтерского учета и аудита
Очное отделение
Выпускница (специалист)
Работа
Информация не указана или скрыта настройками приватности
Хобби, интересы, увлечения
Деятельность
Не указано или скрыто
Интересы
Не указано или скрыто
Любимая музыка
Не указано или скрыто
Любимые фильмы
Не указано или скрыто
Любимые книги
Не указано или скрыто
Любимые игры
Не указано или скрыто
Любимые TV-шоу
Скрыто или не указано
Любимые цитаты
Не указано или скрыто
О себе
Информация скрыта или не указана
Жизненная позиция
Главным в жизни считает
Скрыто или не заполнено
Главным в людях считает
Скрыто или не заполнено
Политические предпочтения
Скрыто или не заполнено
Источники вдохновения
Скрыто или не заполнено
Мировоззрение
Скрыто или не заполнено
Как относится к алкоголю
Скрыто или не заполнено
Как относится к курению
Скрыто или не заполнено
Список друзей
К сожалению, не удаётся получить список друзей Лены.
Если статус профиля VK значится как «закрытый», это вполне нормально.
В противном случае попробуйте обновить данную страницу, иногда это помогает.
Удалить страницу
Если Вы являетесь владельцем этого vk профиля id3726289, можете легко его удалить с сайта profiles-vkontakte.ru, вся информация с этой страницы исчезнет, будто её тут и не было никогда. И гарантированно не появится тут снова.
Для удаления придётся кое-что сделать, чтобы алгоритм мог Вас идентифицировать, как владельца профиля. Ничего сложного и трудоёмкого: просто в качестве своего статуса ВКонтакте (именно на страничке где id 3726289) напишите pvkontakte123, без всяких пробелов и других символов, после чего нажмите кнопку «УДАЛИТЬ ПРОФИЛЬ».
Так система поймёт, что Вы — это действительно Вы, после чего произойдёт удаление, полностью в автоматическом режиме. Разумеется, после успешного удаления можно удалить статус pvkontakte123, поменять его, делать с ним всё что угодно — идентификация более не требуется.
А теперь ещё раз, коротко:
- Устанавливаете статус pvkontakte123
- Нажимаете кнопку УДАЛИТЬ ПРОФИЛЬ
- Вся публичная информация из vk о вас удаляется с profiles-vkontakte.ru навсегда.
Удалить профиль
Елена Троянская — это… Что такое Елена Троянская?
Елена Прекрасная (греч. Ἑλένη, Ἑλένα) — в древнегреческой мифологии [1] прекраснейшая из женщин. По Ликофрону, мойры определили ей иметь пять мужей [2].
Рождение Елены
По одному рассказу, она была дочерью Зевса и спартанской царицы Леды [3] (по Еврипиду, третья дочь [4]). По другой версии, была зачата в Рамнунте (Аттика), где Зевс в образе лебедя овладел Немесидой [5], и родилась из яйца [6], Гермес положил это яйцо на колени Леды [7]. Яйцо хранилось в храме Левкиппид в Спарте [8]. По другой версии, её мать — океанида [9]. По Птолемею Гефестиону, Елена — дочь Гелиоса и Леды [10].
Елена и Тесей
Елена была самой прекрасной из женщин, даже богини завидовали ей. Герой Аттики Тесей с помощью Пирифоя похитил Елену из Спарты, когда ей было 12 лет [11] (либо когда ей было 10 лет [12]), когда она плясала в храме Артемиды Орфии [13] или приносила жертву в святилище Артемиды [14]. Её братья Полидевк и Кастор освободили Елену и вернули в дом Тиндарея, она осталась девушкой. Согласно же Стесихору, когда Елена вернулась из Афин, она была беременна и родила в Аргосе дочь Ифигению, основав там храм Илифии [15].
Свадьба Елены
За Елену сватались множество женихов, но Тиндарей опасался распрей и никак не мог решиться отдать Елену замуж. Одиссей предложил Тиндарею предоставить право выбора жениха самой Елене, которая выбрала прекрасного сына Атрея Менелая, который после смерти Тиндарея стал царём Спарты.
Елена в Трое
Когда Менелай отсутствовал в Спарте, Елена была похищена троянцем Парисом, чем подан был повод к троянской войне. Похищение, согласно Ликофрону, произошло с побережья у Гифии [16], когда Елена приносила жертву Фисадам и Бино [17], согласно Дарету — у Гелоса, согласно Птолемею Гефестиону — когда она охотилась на горе Парфений [18], согласно Драконцию — из храма Афродиты на Кипре [19].
Впервые насладилась любовью с Парисом на острове Краная [20], это либо Акте — Краная в Лаконии или в Аттике [21], по мнению же Цеца — Саламин. По версии, восходящей к Стесихору, Гера создала её призрак, который похитил Парис, а Гермес перенес настоящую Елену в дом Протея [22], и она провела в Египте 17 лет [23]. Согласно Гомеру, провела в Трое 20 лет [24]. После гибели Париса она стала женой Деифоба.
Она узнала Диомеда и Одиссея, когда они похищали Палладиум из Трои [25] (или только Одиссея [26]). По Еврипиду, пыталась бежать из Трои, но Деифоб помешал ей [27]. Вызывала героев, сидевших в троянском коне [28]. По версии, показала со стены факел и предала Трою [29]. По Вергилию, в ночь взятия Трои пряталась в храме Весты [30]. Менелай выронил меч, увидев её обнаженной [31]. Её хотели побить камнями (неясно, кто), но, увидев её лицо, уронили камни на землю [32]. Изображена на картине Полигнота в Дельфах [33].
По предсказанию оракула, плывя из Трои, она выбросила в море треножник работы Гефеста, который нашли косские рыбаки, затем он попал к семи мудрецам [34].
Смерть Елены
После войны Орест и Пилад хотели убить её [35]. По спартанской версии, её могила в местечке Ферапна около Спарты [36]. Её святилище в Спарте, рядом с ним могила Алкмана [37].
По родосской версии, после смерти Менелая Елена была изгнана Никостратом и Мегапенфом и прибыла на Родос к своей знакомой Поликсо, вдове Тлеполема. Поликсо, желая отомстить ей за гибель мужа, подослала к ней, когда она купалась, своих служанок в образе Эриний. Они захватили Елену и повесили её на дереве. Поэтому у родосцев есть храм Елены Дендритиды (Древесной) [38]. По другому рассказу, родосцы лишь побили камнями служанку, которую Менелай одел в платье Елены [39]. О связи Елены с деревьями упоминает Феокрит [40].
По Птолемею Гефестиону, на обратном пути из Трои Елена была убита Фетидой, принявшей облик тюленя [41], по другой версии его же пера, Менелай и Елена искали Ореста, и Ифигения принесла их в жертву Артемиде [42]. Согласно Стесихору и кротонцам, Елена после смерти стала женой Ахилла и поселилась на острове Левка в устье Дуная [43].
Образ в искусстве
Действующее лицо трагедий Софокла «Похищение Елены, или Елена», «Свадьба Елены», Еврипида «Троянки», «Елена» и «Орест», Диогена и Феодекта «Елена», Сенеки «Троянки», комедий Алексида «Женихи Елены» и «Похищение Елены».
Образ Елены Прекрасной часто встречается и в русских сказках.
Примечания
- ↑ Мифы народов мира. М., 1991-92. В 2 т. Т.1. С.431-432, Любкер Ф. Реальный словарь классических древностей. М., 2001. В 3 т. Т.2. С.97
- ↑ Ликофрон. Александра 146
- ↑ Псевдо-Аполлодор. Мифологическая библиотека III 10, 7-8 далее
- ↑ Еврипид. Ифигения в Авлиде 51
- ↑ Стасин. Киприи, фр.9 Бернабе
- ↑ Псевдо-Эратосфен. Превращения в звезды 25, со ссылкой на Кратина
- ↑ Гигин. Астрономия II 8
- ↑ Павсаний. Описание Эллады III 16, 1
- ↑ Гесиод. Перечень женщин, фр.24 М.-У.
- ↑ Комментарий Д. О. Торшилова в кн. Гигин. Мифы. СПб, 2000. С.98
- ↑ Псевдо-Аполлодор. Мифологическая библиотека Э I 23
- ↑ Диодор Сицилийский. Историческая библиотека IV 63, 2
- ↑ Плутарх. Тесей 31
- ↑ Гигин. Мифы 79
- ↑ Стесихор. Елена, фр.191 Пейдж = Павсаний. Описание Эллады II 22, 6
- ↑ Ликофрон. Александра 97 и схолии
- ↑ Ликофрон. Александра 106 и комм.
- ↑ Комментарий Д. О. Торшилова в кн. Гигин. Мифы. СПб, 2000. С.114
- ↑ Драконций. Похищение Елены 488
- ↑ Гомер. Илиада III 445
- ↑ Ликофрон. Александра 109
- ↑ Еврипид. Елена 31-36
- ↑ Еврипид. Елена 112—114
- ↑ Гомер. Илиада XXIV 765
- ↑ Лесх. Малая Илиада, синопсис; Софокл. Лаконянки, фр.367-368 Радт
- ↑ Гомер. Одиссея IV 241—258; Псевдо-Аполлодор. Мифологическая библиотека Э V 13
- ↑ Еврипид. Троянки 956—960
- ↑ Гомер. Одиссея IV 271—289; Трифиодор. Взятие Илиона 471
- ↑ Гигин. Мифы 249; Трифиодор. Взятие Илиона 520
- ↑ Вергилий. Энеида II 567—574
- ↑ Еврипид. Андромаха 628; Аристофан. Лисистрата 155
- ↑ Стесихор. Елена, фр.201 Пейдж
- ↑ Павсаний. Описание Эллады X 25, 4
- ↑ Плутарх. Солон 4; Диоген Лаэртский I 32, ссылка на оракул Аполлона
- ↑ Еврипид. Елена 1455—1502
- ↑ Павсаний. Описание Эллады III 19, 9
- ↑ Павсаний. Описание Эллады III 15, 3
- ↑ Павсаний. Описание Эллады III 19, 9-10
- ↑ Полиэн. Стратегемы I 13
- ↑ Феокрит. Идиллии XVIII 48
- ↑ Комментарий Д. О. Торшилова в кн. Гигин. Мифы. СПб, 2000. С.142-143
- ↑ Вестник древней истории. 1947. № 4. С.278
- ↑ Павсаний. Описание Эллады III 19, 11-13; Конон. Мифы 18
Литература
- Clader L.L. Helen: The Evolution from Divine to Heroic in Greek Epic Tradition. Leiden, 1976.
Wikimedia Foundation. 2010.
ТЮРИНА Ирина Анатольевна (Ирина Нельсон)
Ирина Нельсон является основательницей и ведущей вокалисткой группы «Рефлекс», известнейшей российской артисткой, музыкальным продюсером и просто красивой и талантливой женщиной. Ирина Нельсон — творческий псевдоним нашей сегодняшней героини, ее настоящее имя — Ирина Анатольевна Тюрина, девичья фамилия — Терёшина. Некоторое время выступала под именем «Диана» (в честь Дайаны Росс). Популярность певице принесли такие композиции как: «Люблю», «Жесткое диско», «Сойти с ума» и «Я разбила небо», которые со временем стали хитами. Женщина ведет здоровый образ жизни и занимается спортом, а также преподает йогу и ведет собственный проект о здоровье под названием Life108.
Ирина Нельсон — российская певица, автор песен и продюсер
Восемнадцатого мая 2017 года была удостоена Ордена «За заслуги перед Отечеством» второй степени. Певице сорок шесть лет. Она дважды была замужем. Первым супругом был швед Андреас Нельсон. В браке родился сын, которого назвали Антоном. Во второй раз пошла под венец со своим продюсером Вячеславом Владимировичем Тюриным. В 2010 году Ирина Нельсон стала бабушкой прелестного мальчика по имени Кристоф.
Ирина Тюрина — основатель и многолетняя солистка группы Reflex
Биография: семья, детские и юношеские годы певицы
Будущая артистка появилась на свет девятнадцатого апреля 1972 года. Детские и юношеские годы проходили в городе Барабинск. Ирина из простой в семье рабочих. Глава семьи — Терёшин Анатолий Васильевич всю жизнь исполнял обязанности машиниста локомотива. Маму зовут Раисой Ивановна. Женщина была домохозяйкой, она занималась воспитанием детей и домашним хозяйством – держала коров и кроликов. Ирина была младшим ребёнком в семье. У неё есть старшая сестра Вера.
С самого детства родители обнаружили у Иры артистические способности. Уже тогда все знали, что с маленькой девочки вырастет большая звезда. В трёхлетнем возрасте юная артистка любила петь мелодичные украинские песни вместе с бабушкой, мамой и сестричкой. Когда Ирина немного подросла её отправили в музыкальную школу. Сестра Вера играла на домбре, а она сама на фортепиано.
Ирина Нельсон (Тюрина) — обладательница 19 музыкальных наград
В старших классах девушку заметил руководитель школьного джазового ансамбля, ему очень понравился голос нашей героини, и вскоре он пригласил Ирину в свой коллектив. Целеустремленная девушка с энтузиазмом выполняла все вокальные упражнения. Тренировки голова проходили даже дома. Это было настолько громко, что соседи возмущенно стучали в стену.
Тогда Ирине Терёшиной пришлось придумать оригинальный способ занятий, позволявший никому не мешать, во время репетиций. Уткнувшись в подушку, она закрывалась в шкафу и пела свои ми-ме-ма-мо-му. В 1989 году наша сегодняшняя героиня окончила среднее образование и поступила в Новосибирское музыкальное училище, после которого стала преподавателем игры на фортепиано. Во время студенчества талантливая Ира являлась вокалисткой в джазовом оркестре музыкального училища.
Ирина Нельсон (Тюрина) — дипломированный преподаватель йоги
Творческий путь певицы: начало
В начале 90-х годов она приняла участие в форуме молодых исполнителей, который проходил в курортном городе Ялте. На форуме девушка познакомилась с композитором и продюсером Вячеславом Владимировичем Тюриным. Мужчина предложил ей стать солисткой группы «Электроверсия», этим самым молодой певице был открыт путь в российский шоу-бизнес.
Ирина Нельсон (Тюрина) — солистка группы «Электроверсия»
В 1991 году вышла дебютная песня группы под названием «В пять у метро». Композиция возглавила хит-парад «Московского комсомольца». Это стало хорошим началом звездной карьеры для начинающей певицы. В 1992 году начала выступать сольно под псевдонимом «Диана». Спустя год певица выпустила свой первый альбом «Вечер с Дианой».
Ирина Нельсон (Тюрина)
На протяжении последующих шести лет вышло шесть студийных дисков нашей героини. Самыми популярными были: «Я вернусь» и «Я хочу любить», а также ремиксовый альбом и сборник «The Best». В 90-е годы певица Диана много гастролировала. В 1993 году Ирина Нельсон исполняла свои композиции на музыкальном форуме во французском городе Канны, этого же года стала участницей концерта «Песне года», который проходил в Соединенных Штатах Америки.
В конце 90-х годов певица «Диана» закончила свою сольную карьеру и со своим мужем Андреасом Нельсоном переехала жить в Германию, там же и родился их сын. За рубежом Ирина познакомилась с участником дуэта «Modern Talking» Дитером Боленом и певцом DJ Bobo. Эти знакомства оказали влияние на её дальнейшее творчество. Брак с Андреасом Нельсоном был недолговременным. После развода артистка вернулась на родину. Бывший режисер Вячеслав Владимирович Тюрин предложил ей стать солисткой группы «Reflex».
Reflex и сольная карьера Ирины Нельсон
Наша героиня является одной из основателей группы «Reflex». Коллектив был одним из самых популярных и успешных на российской эстраде того времени. Настоящий успех нашей сегодняшней героине принесла песня «Сойти с ума», премьера которой состоялась в 2001 году. Данная композиция стала лидером симпатий слушателей «Русского радио». В 2002 году группа «Reflex» получила свой первый «Золотой граммофон».
Ирина Нельсон (Тюрина) — основатель и многолетняя солистка группы Reflex
Популярности коллективу прибавил диск «Non-Stop». В 2003 году «Reflex» представлял Российскую Федерацию на фестивале Pop Komm в городе Кёльне. В 2004 году в сотрудничестве с Babelspark и Sony Music поп-коллектив работал над синглом под названием «I Can’t Live Without You». В чартах Федеративной Республики Германии музыкальная композиция заняла четвертую позицию.
Взрослые девочки «Reflex»
В 2007 году артистка впала в сильнейшую депрессию. Она покинула «Reflex» и ушла в творческий отпуск. Вместе с мужем она отправилась на лечение в Дубаи. После отдыха в знаменитой лондонской Air Studio записала сольный альбом, песни которого были на английском языке. В создании музыкальной пластинки ей помогал звукорежиссер Стив Орчард, который ранее работал с такими музыкальными гигантами, как Элтон Джон, Джордж Майкл и Пол Маккартни. Музыкант по достоинству оценил вокальные данные звезды российской эстрады.
Взрослые девочки группы «Reflex» с Ириной Нельсон
Некоторое время работала в Соединенных Штатах Америки в тандеме со своим супругом Вячеславом. В 2009 году в Соединенных Штатах Америки вышел сольный альбом поп-исполнительницы на английском языке под названием «Sun Generation» с синглом Sunrise, а через три года вышла русскоязычная версия это того же альбома только уже в России под названием «Теплое солнце», и с синглом — «Рассвет».
Группа «Reflex» с Ириной Нельсон
В 2010 году Ирина появлялась на американском телеканале «Евроканал», а издание журнала «Glam» опубликовало о ней статью. В 2012 году певица вернулась в группу «Reflex» и параллельно продолжала свою сольную карьеру.
Совместное творение коллектива под названием «Я буду небом твоим», оказалось на первой строчке хит-парада «Русского радио», а спустя год композиция была удостоена «Золотого граммофона». В 2012, 2013 и 2014 годах коллектив работал над созданием альбома «Воспоминания о будущем». В основном пластинка объединила в себе прежние успешные хиты. В 2015 году группа «Reflex» выпустила две песни- «Взрослые девочки» и «Художник», а в 2016 году- «Все что хотела» и «Говори со мной».
Личная жизнь
Свою первую любовь Ирина встретила еще во время учебы в музыкальном училище. Девушка с первого взгляда влюбилась в голубоглазого скрипача по имени Андреас Нельсон. Молодой человек долгое время не отвечал взаимностью. Музыканту понадобилось немного времени, чтобы узнать девушку поближе. У Иры и Андреаса завязался страстный роман. И вскоре влюбленные решили узаконить свои отношения.У них родился сын Антон, который в свою очередь в 2010 году подарил родителям внука Кристофа. Именно благодаря первому супругу певица начала интересоваться буддизмом и йогой. К сожалению, брак Ирины и Андреаса Нельсона продлился недолго.
Вторым мужем артистки стал известный композитор, продюсер, клипмейкер и режиссёр — Вячеслав Владимирович Тюрин. Ирина его очень любит и ценит за профессионализм и невероятную жажду жизни. Общих детей пара не имеет.
Ирина Нельсон (Тюрина) с мужем Вячеславом Тюриным
Ирина очень любит наблюдать за тем, как горит огонь и даже коллекционирует свечи. В свободное от работы время предпочитает проводить за чтением любимой книги или просмотром хорошего фильма. Артистка без ума от британского актера Бенедикта Камбербэтча. Ей нравятся все фильмы с его участием, а особенно историческая драма «Игра в имитацию».
Проект о здоровье Life108
Артистка следит за своим здоровьем. Она считает себя вегетарианкой, полностью отказалась от мяса, рыбы и яиц. В пищу употребляет только фрукты, овощи и бобовые. Ирина Нельсон уже много лет увлекается буддизмом и практикует йогу, которую называет союзом человека со Вселенной. Начиная с 2010 года занимается йогой профессионально. Этому занятию она уделяет двенадцать часов в сутки.
Ирина много времени уделяет йоги
Она является дипломированным преподавателем по учению Йоги Бхаджана. Диплом наша героиня получила после прохождения специальной подготовки в Лос-Анджелесском Международном институте исследования Кундалини — профессионального преподавателя кундалини-йоги. Ирина также основала свой собственный проект о красоте и здоровье Life108. В котором делится секретами красивой фигуры, и рассказывает, как стать долгожителем.
Последние новости о Ирине Нельсон
В 2017 году за участие в благотворительных концертах на Донбассе во время боевых действий президент России Владимир Владимирович Путин удостоил Ирину почетным орденом «За заслуги перед Отечеством» второй степени. Она отличилась в 2016 году, когда сняла клип в Крыму на композицию «Говори со мной».
Награждение певицы вызвало в обществе резонанс недоумения. Ситуация возмутила журналистку Наталью Радулову и блогера Лену Миро, а цирковой артист Эдгард Запашный в своем «Instagram» выложил откровенные фотографии Ирины, под которыми подписал, что не хотел бы стоять в одном ряду с такими орденоносцами. На защиту артистки стали поклонники и родственники. Они утверждали, что в наше время такие откровенные наряды на сцене не запрещены и в этом ничего позорного нет. В жизни Нельсон предпочитает стиль casual, бохо-стиль. Певица продолжает заниматься сольной карьерой и находится в отличной музыкальной форме, регулярно гастролирует по стране.
Ирина Нельсон — российская певица, автор песен и продюсер
В 2018 году Ирина Нельсон презентовала новую композицию под названием «Не дай ему уйти». Весной этого же года артистка дала интервью для журнала «Prime one», где поделилась тайнами своей биографии и сокровенными мыслями. Также ее пригласили стать экспертом на реалити-шоу «Дом-2. Остров любви».
Талантливая Ирина очень востребованная артистка на российской эстраде. Она является обладательницей девятнадцати музыкальных наград. Для многих Ирина Нельсон — пример для подражания, ее творчеством восхищается вся страна.
Она имеет спортивную безупречную фигуру и не стесняется показать свое тело. Артистка прославилась многочисленными фотосессиями эротического характера, которые включали в себя фото ню и на тематику лесбийской любви. В 2007 году Ирина была в списке ста привлекательных женщин мира по версии британского мужского издания «For Him Magazine».
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Апрель 2006 г. | Шаффнит, Рэйчел | Сапатисты и демократизация в Мексике |
---|---|---|
Апрель 2006 г. | Паттерсон, Лаура | Las disputas linguisticas en Mexico, колониальная (1492-1592) |
Апрель 2006 г. | Кендрик, Эшли | Дева Гваделупская: всеобщее обращение Морены Марии |
Апрель 2006 г. | Немес, Брендан | Роль социального и технологического развития в завоевании Империи ацтеков |
Апрель 2006 г. | Фут, Эллисон | Nicht Im Kern Verrottet Не гнилой по сути Экзамен по реформе высшего образования в Германии |
Апрель 2006 г. | Тервиллигер, Эллисон | Феликс Уфуэ-Буаньи и зависимое развитие Кот-д’Ивуара |
Апрель 2006 г. | Фергюсон, Элизабет Энн | Самая старая профессия в мире: исследование проституции в Германии |
Апрель 2006 г. | Льюис, Меган | Объединение зеленых и Альянса 90 в объединенной Германии |
Апрель 2006 г. | Беннет, Хиллари | Истоки фашизма во Франции: французское действие с 1899 по 1944 год |
Апрель 2006 г. | Мазур, Дана Линн | Lebensborn Eingetragener Verein: Программа арийских рас СС |
Апрель 2006 г. | Орндорф, Бен | Немецкий милитаризм: исследование немецкой военно-политической культуры |
Апрель 2006 г. | Гербер, Лена | Экстремистские традиции во все более интегрированной и многокультурной Франции: Национальный фронт Франции |
Апрель 2006 г. | Скейфорд, Аманда | Было ли «смелости к переменам» Шредера достаточно, чтобы помочь немецкому рынку труда? Политический и экономический анализ реформ Харца в Германии |
Апрель 2006 г. | Бартосевич, Анна | Институциональное использование языка в Европейском Союзе |
Апрель 2006 г. | Брин, Берри Тейлор | Дегенеративная траектория: искусство, политика и идеология в Германии 1850-1937 гг. |
Апрель 2005 г. | Оукс, Келси | Влияние политической культуры на гаитянскую демократию |
Апрель 2005 г. | Пэтси, Мария Тереза | Взгляд на швейцарский нейтралитет и экономику и их влияние на швейцарский «нет» Европейскому союзу |
Январь 2005 г. | Мейер, Эмили Джейн | Глобализация и изменение представлений о роскоши от кутюр: политический, исторический и экономический анализ |
Ноябрь 2004 г. | Сарич, Ирена | Роль прокуратуры в гражданских и социалистических правовых системах; Сравнительное исследование Франции, Российской Федерации и Чехии |
Апрель 2004 г. | Соломорезка, Алисса | Кровь и принадлежность: почему Германия изменила законы о гражданстве в 1999 году |
Апрель 2004 г. | Россман, Николай | Анализ политики allgemeine Wehrpflicht (обязательная военная служба) в немецкой армии (Heer) |
Апрель 2004 г. | Роджерс, Лорен | Проблемы и перспективы воссоединения Берлина |
Апрель 2004 г. | Мозер, Лорен | Организованный труд и государство в Мексике: отношения любви и ненависти |
Апрель 2004 г. | Джеймс, Райан | Оценка эволюции президентской системы Мексики: институт президентства и президенты Мексики |
Апрель 2004 г. | Hrnicar, Майкл | Социальные и литературные причины Декларации прав человека |
Апрель 2004 г. | Фраас, Керри | Можно ли спасти солидарность? Исследование немецкой пенсионной реформы |
Апрель 2004 г. | Deascenti, Кристен | Углубленный анализ иммигрантов в немецкой экономике: облегчение или бремя |
Апрель 2004 г. | Брэндон, Джонатан | Исследование интеграции Испании в Европейский Союз: роль государства |
Апрель 2004 г. | Бердал, Siri | Скрытые мотивы? Воздержание Франции от Второй войны в Персидском заливе |
Апрель 2004 г. | Андерсон, Хизер | Переход от немецкой марки к евро — это история успеха? |
Декабрь 2003 г. | Рамбо, Байрон | Предсказание будущего: неофункционализм и Европейский союз |
Апрель 2003 г. | Хреха, Джон | Трещина в демократии; Грязная война Мексики? |
Апрель 2003 г. | Пафф, Рэй Энн | Феминизм в отечестве: сравнительное исследование положения женщин в восточной и западной частях Федеративной Республики Германии в 1990 г. |
Апрель 2003 г. | Павасович, Тамара | Этническая принадлежность и религия в Боснии: влияние ислама 1990-1995 гг. |
Ноябрь 2002 г. | Buckingham, Lyndsay | Туризм в Испании: анализ экономических и социальных эффектов |
Апрель 2002 г. | Брэдли, Келли | Улучшение положения женщин в сфере образования и занятости: на примере Испании |
Декабрь 2001 г. | Рехман, Айша | Эволюция мусульманского присутствия во Франции |
Апрель 2001 г. | Эрлих, Сет | Наследие Второй мировой войны: неудачные возможности Германии противостоять моральным вопросам нацистского режима |
Апрель 2001 г. | Кобаяши, Хикару | Культ Мао и современный Китай |
Апрель 2001 г. | Varanthungarajan, Ребекка | Исследование глобализации во Франции: ее влияние на экономику, политику и культуру |
Декабрь 2000 г. | МакКлюр, Меган | Музыка под нацистским контролем: цензура, изгнание и культурное наследие |
Декабрь 2000 г. | Бетлер, Тимофей | Радикальные правые в Западной Европе: объяснения и наблюдения на примере Австрии и Партии свободы |
Ноябрь 2000 г. | Кетзан, Кристоф | Иммиграция и политика гражданства в современной Франции |
Ноябрь 2000 г. | Vignale, Tina | Объединение окружающей среды Германии: экономика, политика и перспективы |
Апрель 2000 | Гербок, Джастин | Крепость Европа: создание торговли или ее отклонение? Французская перспектива |
Апрель 2000 | Миллер, ДеМарко | Футбол: больше, чем просто игра |
Апрель 2000 | Рорер, Одри | Итак, в чем разница? Пропаганда, туризм и построение национальной идентичности во франкистской Испании |
Апрель 2000 | Шулер, Джейсон | Öffentliche Politik, Finanzierung und das Geschäftsklima: Existenzgründung und der Kleinunternehmenssektor in den neuen Bundesländern |
Апрель 1999 г. | Siepel, Бенджамин | Влияние чумы на экономику и общество в позднесредневековой Англии |
Апрель 1999 г. | Ричардсон, Энн | Евро и бизнес: исследование того, как евро повлияет на европейские корпорации с особым упором на подготовку французских фирм |
Апрель 1999 г. | Quick, Кристина | Европейский парламент: поиск легитимности за пять десятилетий |
Апрель 1999 г. | Lehky, Dyane | Гватемала или Гватемала?: Сравнение кофе и бананов, используемых для роста за счет первичного экспорта в Гватемале |
Апрель 1999 г. | Давит, Сара | Югославский кризис: анализ возможных мотивов решения Германии признать Хорватию и Словению |
Апрель 1999 г. | Карренс, Мишель | Двигаясь вверх по лестнице к успеху: политическое, культурное и историческое исследование Немецкой партии зеленых |
Апрель 1999 г. | Кортес, Виктория | Сокращение рабочей недели во Франции: анализ закона Обри и его влияние на занятость |
Апрель 1999 г. | Андерсон, Коэлле | Der Wissenschaftler im modernen deutschen Drama: Eine Analyze von Kaisers Gas I, Brechts Leben des Galilei, Kipphardts In der Sache J.Роберт Оппенгеймер, унд Дюрренматтс Die Physiker |
Март 1999 г. | Кудер, Маргарет | Изучение второго языка: сравнение детей и пожилых людей |
Декабрь 1998 г. | Ровансек, Фарра | Размышления о прошлом французской винодельческой промышленности: Bordeaux Grands Crus использовались как возможности для инвестиций в двадцатом веке |
Апрель 1998 г. | Хантер, Лесли | Поглощение железа и марганца тремя видами водных макрофитов в водно-болотных угодьях, уменьшающих кислотный дренаж шахты |
Апрель 1998 г. | Мейсон, Анджела | Пришло время перемен? Швейцария задумывается о европейской интеграции |
Апрель 1998 г. | Йодер, Дарын | Призраки прошлого Австрии: исследование процесса Vergangenheitsbewältung в Австрии |
Декабрь 1997 г. | Макгаффик, Кэрри | Решение Японии не ремилитаризоваться в эпоху после Второй мировой войны: политически, экономически и социально |
Май 1997 | Нортруп, Виктор | Die Lyrik von Johannes Bobrowski |
Апрель 1997 г. | Кульдкепп, Эло | Опыт Эстонии с монетаризмом — исследование денежно-кредитной политики Эстонии и ее влияния на экономику |
Декабрь 1996 г. | Джейкобс, Аманда | La Gréve et les Syndicats: Забастовка ноября — декабря 1995 г. и упадок французских профсоюзов |
Декабрь 1996 г. | Коулман, Хизер | В какой степени индейцы каяпо из Центральной Бразилии были затронуты стремлением к развитию внутренних районов Бразилии во второй половине двадцатого века |
Ноябрь 1996 г. | Тюрина, Алла | Прямые иностранные инвестиции в России: затраты и выгоды |
Май 1996 г. | Тинни, Эллисон | Французская колонизация, изменения в землепользовании и ухудшение состояния окружающей среды в Сенегале |
Май 1996 г. | Backhaus, Мелани | Роль разведывательного сообщества США в экономическом шпионаже: сравнительный анализ французских и американских агентств |
Апрель 1996 г. | Швейцер, Эрика | Ухудшение состояния окружающей среды в бывшей Германской Демократической Республике: анализ последствий, социальных движений и политики в ходе воссоединения |
Апрель 1996 г. | Раген, Стейси | Трансформация голлистской внешней политики по отношению к Европейскому Союзу |
Апрель 1996 г. | Эрнквист, Тимоти | Объединение Германии: экономические последствия и поглощение бывшей Восточной Германии |
Апрель 1995 г. | Джейкоби, Мэри | Барьеры для свободной торговли: проверка торговой политики Франции |
Апрель 1995 | Хайланд, Келли | Французский опыт экспорта ядерной энергии |
Апрель 1995 г. | Флаэрти, Даниэль | Вмешательство, обман и изъятие |
Апрель 1994 | Москва, Войтек | Внешняя торговля и переходный период в Польше: политический и экономический анализ |
Апрель 1992 г. | Марон, Эрик | Закон о содействии занятости 1969 г. Снова! |
Апрель 1992 г. | Чендлер, Э. | Движение инакомыслия в Восточной Германии: 1980 г. — 9 ноября 1989 г. |
Апрель 1992 г. | Махони, Патрик | Ядерные силы средней дальности: Федеративная Республика Германия и Договор о РСМД |
Апрель 1991 | Каспер, Эдвард | Берлинская стена |
Ноябрь 1990 | Петри, Дэвид Лео | Цели Франции в Рур и Саар после Второй мировой войны Германия |
Январь 1990 | Sauerbrey, Сара | Gesetze Gegen Homosexuellen und Juden |
Апрель 1986 | Мюллер, Корина | Исследование преимуществ и недостатков транснациональной компании в Бразилии с использованием истории индустриализации и экономических теорий на примере автомобильной промышленности |
Грубиша, Т.J. | Неизбежность Югославии: исторический экономический взгляд на крах |
Олимпийские результаты по плаванию | Федеральная новостная сеть
Пятница
Мужчины
100м Бабочка
Полуфиналы
Полуфинал 1
1. Кристоф Милак, Венгрия, 50.31.
2. Иосиф Миладинов, Болгария, 51.06.
3. Андрей Минаков, ОКР, 51.11.
4.Мэтью Темпл, Австралия, 51.12.
5. Мехди Метелла, Франция, 51.32.
6. Наоки Мизунума, Япония, 51.46.
7. Сунь Цзяцзюнь, Китай, 51.82.
8. Юсеф Рамадан, Египет, 52.27.
Полуфинал 2
1. Келеб Дрессел, США, 49.71.
2. Ноэ Понти, Швейцария, 50.76.
3. Якуб Майерски, Польша, 51.24.
4. Луис Карлос Мартинес, Гватемала, 51.30.
5. Джошуа Линдо Эдвардс, Канада, 51.50.
6. Нилс Корстанье, Нидерланды, 51.80.
7. Себастиан Сабо, Венгрия, 51.89.
8. Том Шилдс, США, 51,99.
На спине 200 м
Финал
1. Евгений Рылов, ОКР, 1: 53.27.
2. Райан Мерфи, США, 1: 54.15.
3. Люк Гринбэнк, Великобритания, 1: 54.72.
4. Брайс Меффорд, США, 1: 55.49.
5. Адам Телегди, Венгрия, 1: 56.15.
6. Радослав Кавецкий, Польша, 1:56.39.
7. Риосуке Ирие, Япония, 1: 57.32.
8. Николя Гарсиа Саис, Испания, 1: 59.06.
Индивидуальное плавание, 200 м
Финал
1. Ван Шунь, Китай, 1: 55.00.
2. Дункан Скотт, Великобритания, 1: 55.28.
3. Джереми Депланш, Швейцария, 1: 56.17.
4. Дайя Сэто, Япония, 1: 56.22.
5. Майкл Эндрю, США, 1: 57.31.
6. Косуке Хагино, Япония, 1: 57.49.
7. Ласло Чех, Венгрия, 1:57.68.
8. Льюис Клерберт, Новая Зеландия, 1: 57,70.
50 м вольный стиль
Тепло 1
1. Адам Жирар де Лангладе Мпали, Габон, 27.66.
2. Жозе Жоао да Силва Вьегас, Восточный Тимор, 28.59.
3. Диосдадо Мико Эянга, Экваториальная Гвинея, 31.03.
Тепло 2
1. Шарли Нджуме, Камерун, 27:22.
2. Хуссейн Габер Ибрагим, Джибути, 27.41.
3. Эбрима Сорри Буаро, Гамбия, 27.44.
4. Шон Дингилиус Уоллес, Палау, 27.46.
5. Фахим Анвари, Афганистан, 27.67.
6. Филип Киноно, Маршалловы Острова, 27.86.
Тепло 3
1. Мавупемон Отогбе, Того, 25.68.
2. Трой-Пина, Кабо-Верде, 25.97.
3. Сантисук Интхавонг, Лаос, 26.04.
4. Олимжон Ишанов, Таджикистан, 26.12.
5. Мамаду Ба, Гвинея, 26.52.
6. Абдельмалик Муктар, Эфиопия, 26.65.
7. Симанга Дламини, Эсватини, 26.94.
8. Джошуа Вайс, Сьерра-Леоне, 27.90.
Тепло 4
1. Шейн Кадоган, Сент-Винсент и Гренадины, 24.71.
2. Алассан Сейду Лансина, Нигер, 24,75.
3. Md Ariful Islam, Бангладеш, 24.81.
4. Пуч Хем, Камбоджа, 24.91.
5. Марк Паскаль Пьер Дансу, Бенин, 24,99.
6. Адама Уэдраого, Буркина-Фасо, 25.22.
7. Элои Манирагуха, Руанда, 25.38.
8. Шакил Муса, Замбия, 25:54.
Тепло 5
1. Люк Гебби, Филиппины, 22.84.
2. Эмир Муратович, Босния и Герцеговина, 22.91.
3. Артур Барсегян, Армения, 23.14.
4. Алаа Масо, Олимпийская сборная МОК по беженцам, 23.30.
5. Николас Антониу, Кипр, 23.38.
6. Гирмаи Ефрем, Эритрея, 23.94.
7. Филипе Гомеш, Малави, 24.00.
8. Делгерхуу Мягмар, Монголия, 24.63.
Тепло 6
1. Андрей Барна, Сербия, 22.29.
2. Бретт Фрейзер, Каймановы острова, 22.46.
2.Дилан Картер, Тринидад и Тобаго, 22:46.
4. Энцо Мартинес, Уругвай, 22:52.
5. Ренцо Тьон-А-Джо, Суринам, 22:56.
6. Сантьяго Грасси, Аргентина, 22.67.
7. Хван Суну, Южная Корея, 22.74.
8. Давид Попович, Румыния, 22.77.
Тепло 7
1. Владислав Бухов, Украина, 21.73.
2. Санто Кондорелли, Италия, 22.14.
3. Хайко Гиглер, Австрия, 22.17.
4. Али Халафалла, Египет, 22.22.
5. Габриэль Кастано Гарсия, Мексика, 22.32.
6. Конрад Черняк, Польша, 22.33.
7. Хо Ян Яньтоу, Гонконг, 22.45.
8. Усама Сахнун, Алжир, 22.61.
Тепло 8
1. Бруно Фратус, Бразилия, 21.67.
2. Том де Бур, Нидерланды, 21.75.
3. Джесси Путс, Нидерланды, 21.84.
4. Брент Хайден, Канада, 21.85.
5. Майкл Эндрю, США, 21.89.
6. Максим Груссе, Франция, 21.97.
7. Джошуа Лиендо Эдвардс, Канада, 22.03.
8. Никола Мильенич, Хорватия, 22.14.
Тепло 9
1. Кристиан Гколомеев, Греция, 21.66.
2. Климент Колесников, ОКР, 21.88.
3. Владимир Морозов, ОКР, 21.92.
4. Альберто Местре, Венесуэла, 21.96.
5. Мейрон Амир Черути, Израиль, 22.01.
6. Юй Хэксин, Китай, 22.14.
7. Бьорн Селигер, Швеция, 22.19.
8. Ари-Пекка Люкконен, Финляндия, 22.25.
Тепло 10
1. Келеб Дрессел, США, 21.32.
2. Флоран Маноду, Франция, 21.65.
3. Лоренцо Дзацери, Италия, 21.86.
4. Бенджамин Прауд, Великобритания, 21.93.
5. Павел Юрашек, Польша, 21.97.
6. Брэдли Тэнди, Южная Африка, 22.22.
7. Максим Лобановский, Венгрия, 22.25.
8. Кэмерон МакЭвой, Австралия, 22.31.
1500 м вольный стиль
Тепло 1
1. Дэниел Виффен, Ирландия, 15:07.69.
2. Марсело Акоста, Сальвадор, 15: 27.37.
3. Афлах Правира, Индонезия, 15: 29.94.
4. Тео Дрюэн, Монако, 16: 17.20.
5. Марван Али Элькамаш, Египет, DNS.
Тепло 2
1. Феликс Обек, Австрия, 14: 51.88.
2. Кирилл Мартынычев, ОКР, 14: 52.66.
3. Гергей Гюрта, Венгрия, 15: 01.85.
4. Томас Нил, Австралия, 15: 04.65.
5. Майкл Бринегар, США, 15: 04.67.
6.Виктор Йоханссон, Швеция, 15: 05.53.
7. Акос Кальмар, Венгрия, 15: 17.02.
8. Ченг Лонг, Китай, 15: 18.71.
Тепло 3
1. Флориан Веллброк, Германия, 14: 48.53.
2. Дэниел Джервис, Великобритания, 14: 50.22.
3. Сергей Фролов, Украина, 14: 51.83.
4. Доменико Асеренца, Италия, 14: 53,84.
5. Хай Хоанг Нгуен, Вьетнам, 15: 00.24.
6. Антон Ипсен, Дания, 15: 01.58.
7. Хенрик Кристиансен, Норвегия, 15:11.14.
8. Ян Мицка, Чешская Республика, 15: 17.71.
Тепло 4
1. Михаил Романчук, Украина, 14: 45.99.
2. Роберт Финке, США, 14: 47.20.
3. Грегорио Палтриньери, Италия, 14: 49.17.
4. Джек Маклафлин, Австралия, 14: 56.98.
5. Лукас Мартенс, Германия, 14: 59.45.
6. Гильерме Коста, Бразилия, 15: 01.18.
7. Александр Егоров, ОКР, 15: 06.55.
8. Александр Норгаард, Дания, 15:28.70.
Смешанная эстафета 4 x 100 м
Тепло 1
1. Италия (Томас Чеккон; Николо Мартиненги; Федерико Бурдиссо; Алессандро Миресси), 3: 30.02.
2. Китай (Сюй Цзяюй; Янь Цзыбэй; Сунь Цзяцзюнь; Хэ Цзюньи), 3: 31.72.
3. Австралия (Митч Ларкин; Изаак Стаблти-Кук; Дэвид Морган; Кайл Чалмерс), 3: 32.08.
4. США (Джозеф Армстронг; Эндрю Уилсон; Том Шилдс; Блейк Пьерони), 3: 32.29.
5. Канада (Маркус Тормейер; Гейб Мастроматтео; Джошуа Линдо Эдвардс; Юрий Кисил), 3:32.37.
6. Польша (Kacper Stokowski; Jan KOZAKIEWICZ; Jakub Majerski; Jakub KRASKA), 3: 32.62.
7. Беларусь (Никита Цмых; Илья Шиманович; Евгений Цуркин; Артем Мачекин), 3: 34.82.
8. Венгрия (Ричард Бохус; Тамаш Такач; Хуберт Кос; Петер Холода), 3: 34.91.
Женщины
200 м брасс
Финал
1. Татьяна Шенмакер, Южная Африка, 2: 18.95.
2. Лилли Кинг, США, 2: 19.92.
3. Энни Лазор, США, 2:20.84.
4. Евгения Чикунова, ОКР, 2: 20.88.
5. Кайлин Корбетт, Южная Африка, 2: 22.06.
6. Молли Реншоу, Великобритания, 2: 22.65.
7. Эбби Вуд, Великобритания, 2: 23.72.
8. Фанни Леклюз, Бельгия, 2: 24.57.
100м вольный стиль
Финал
1. Эмма МакКеон, Австралия, 51.96.
2. Хоги Шивон Бернадетт, Гонконг, 52.27.
3. Кейт Кэмпбелл, Австралия, 52.52.
4. Пенни Олексиак, Канада, 52.59.
5. Сара Сьестрем, Швеция, 52.68.
6. Фемке Хеемскерк, Нидерланды, 52.79.
7. Анна Хопкин, Великобритания, 52,83.
8. Abbey Weitzeil, США, 53,23.
На спине 200 м
Полуфиналы
Полуфинал 1
1. Эмили Сибом, Австралия, 2: 07.09.
2. Фиби Бэкон, США, 2: 07.10.
3. Райан Элизабет Уайт, США, 2: 07.28.
4. Тейлор Рак, Канада, 2:08.73.
5. Маргарита Панциера, Италия, 2: 09.54.
6. Лена Грабовски, Австрия, 2: 10.10.
7. Африка Саморано Санс, Испания, 2: 10.42.
8. Шарон ван Рувендал, Нидерланды, 2: 12.98.
Полуфинал 2
1. Кайли Масс, Канада, 2: 07.82.
2. Кейли Маккеун, Австралия, 2: 07.93.
3. Лю Ясинь, Китай, 2: 08.65.
4. Пэн Сювэй, Китай, 2: 08.76.
5. Каталин Буриан, Венгрия, 2: 09.65.
6.Татьяна Салкутан, Молдова, 2: 10.09.
7. Лаура Бернат, Польша, 2: 12.86.
8. Авив Барзелай, Израиль, 2: 12.93.
50 м вольный стиль
Тепло 1
1. Имельда Шименес Белу, Восточный Тимор, 32,89.
2. Одрина Казе, Бурунди, 33.39.
3. Ханин Ибрагим, Судан, 34,49.
Тепло 2
1. Альфонсин Агахозо, Руанда, 30.50.
2. Осисанг Чилтон, Палау, 30.67.
3. Тити Думбуя, Сьерра-Леоне, 31.56.
4. Хлоя Совурель, Центральноафриканская Республика, 32.18.
5. Роукая Мусса Махаман, Нигер, 32.21.
6. Айя Жирар де Ланглад Мпали, Габон, 32,24.
7. Стефан Сангала, Конго, 37.92.
8. Нада Аракджи, Катар, DNS.
Тепло 3
1. Анастасия Тюрина, Таджикистан, 29.05.
2. Сири Арун Будчарерн, Лаос, 29.22.
3. Бунпичморакат Кхеун, Камбоджа, 29.42.
4. Лара Дашти, Кувейт, 29.69.
5. Джунайна Ахмед, Бангладеш, 29.78.
6. Нафиссат Раджи, Бенин, 29,99.
7. Робин Янг, Эсватини, 30:41.
8. Дания Нур, Палестина, 30.43.
Тепло 4
1. Джудит Меаури, Папуа-Новая Гвинея, 27.56.
2. Алека Персо, Гайана, 27.76.
3. Анжелика Уэдраого, Буркина-Фасо, 28.38.
4. Мья де Фрейтас, Сент-Винсент и Гренадины, 28.57.
5. Нур Юсуф Абдулла, Бахрейн, 28.87.
6. Джессика Маквенда, Малави, 28.96.
7. День Ноелани Малия, Тонга, 29.06.
8. Алисия Матеуш, Мозамбик, 29.63.
Тепло 5
1. Нора Элизабет Миланези, Камерун, 26.41.
2. Микаили Карл Великий, Сент-Люсия, 26,99.
3. Шайенн-Рова, Фиджи, 27.11.
4. Энххуслен Батбаяр, Монголия, 27.29.
5. Тилка Палйк, Замбия, 27.34.
6. Саманта Робертс, Антигуа и Барбуда, 27.63.
7.Бисма Хан, Пакистан, 27.78.
8. Unilez Takyi, Гана, 27.85.
Тепло 6
1. Аника Дельгадо, Эквадор, 25.36.
2. Элина Филлип, Британские Виргинские острова, 25.74.
3. Никол Меризай, Албания, 26.21.
4. Эмили Мутети, Кения, 26.31.
5. Эма Радич, Хорватия, 26.49.
5. Talita Baqlah, Иордания, 26.49.
7. Кирабо Намутеби, Уганда, 26.63.
8. Наталья Критинина, Узбекистан, 26.93.
Тепло 7
1.Изабелла Арсила Уртадо, Колумбия, 25.41.
2. Бьянка-Андреа Костя, Румыния, 25.61.
3. Джезерик Пинто, Венесуэла, 25.65.
4. Амель Мелих, Алжир, 25.77.
4. Карен Торрес, Боливия, 25.77.
6. Хуанг Мэй-Чиен, Тайвань, 25,99.
7. Эллисон Понсон, Аруба, 26.03.
8. Черелль Томпсон, Тринидад и Тобаго, 26.19.
Тепло 8
1. Лидон Муньос дель Кампо, Испания, 25.10.
2. Фарида Осман, Египет, 25.13.
3. Джули Мейнен, Люксембург, 25.36.
4. Калия Антониу, Кипр, 25.41.
5. Андреа Мурез, Израиль, 25.48.
6. Даниэль Хилл, Ирландия, 25,70.
7. Дженджира Сриса — Ард, Таиланд, 25.97.
8. Тинг Вен Куа, Сингапур, 26.16.
Тепло 9
1. Пернилле Блюм, Дания, 24.12.
2. Кейт Кэмпбелл, Австралия, 24.15.
3. Чжан Юйфэй, Китай, 24.36.
4. У Цинфэн, Китай, 24.55.
5. Фанни Тейонсало, Финляндия, 24.79.
6. Мари Ваттель, Франция, 24.82.
7. Мишель Коулман, Швеция, 24.84.
8. Кайла Санчес, Канада, 24.93.
Тепло 10
1. Эмма МакКеон, Австралия, 24.02.
2. Эмма Челиус, Южная Африка, 24.65.
2. Симоне Мануэль, США, 24.65.
4. Мелани Хеник, Франция, 24.69.
5. Фемке Хеемскерк, Нидерланды, 24.77.
6. Мария Каменева, ОКР, 24.83.
7. Барбора Симанова, Чешская Республика, 24.92.
8. Этьен Медейруш, Бразилия, 25.45.
Тепло 11
1. Сара Сьестрем, Швеция, 24.26.
2. Катаржина Васик, Польша, 24.31.
3. Аббатство Вайтцейл, США, 24.37.
4. Раноми Кромовиджойо, Нидерланды, 24.41.
5. Арина Суркова, ОКР, 24.52.
6. Джули Кепп Йенсен, Дания, 24.70.
7. Хоги Шивон Бернадетт, Гонконг, 24.75.
8. Анна Хопкин, Великобритания, DNS.
Смешанная эстафета 4 x 100 м
Тепло 1
1. Австралия (Эмили Сибом; Челси Ходжес; Брианна Тросселл; Молли О’Каллаган), 3: 55,39.
2. Италия (Маргарита Панциера; Арианна Кастильони; Елена ди Лиддо; Федерика Пеллегрини), 3: 55.79.
3. Япония (Анна Кониси; Канако Ватанабэ; Рикако Ики; Тихиро Игараси), 3: 57.17.
4. Китай (Чэнь Цзе; Тан Цяньтин; Юй Итин; У Цинфэн), 3:57.70.
5. Британия (Кэсси Уайлд; Сара Васи; Харриет Джонс; Фрейя Андерсон), 3: 58.12.
6. Германия (Лаура Ридеманн; Анна Шарлотт Дарсель Элендт; Лиза Хопинк; Анника Брун), 4:00. 16.
7. ЮАР (Мариэлла Вентер; Татьяна Шонмейкер; Эрин Галлахер; Эйми Кэнни), 4: 03.02.
8. Испания (Африка Саморано Санс; Джессика Валль Монтеро; Мирейя Бельмонте; Лидон Муньос дель Кампо), 4: 04.14.
Тепло 2
1. Канада (Тейлор Рак; Сидней Пикрем; Маргарет Макнейл; Кайла Санчес), 3:55.17.
2. США (Райан Элизабет Уайт; Лилли Кинг; Клэр Курзан; Эрика Браун), 3: 55.18.
3. Швеция (Мишель Коулман; Софи Ханссон; Луиза Ханссон; Сара Сьестрем), 3: 56,23.
4. ОКР (Анастасия Фесикова; Юлия Ефимова; Светлана Чимрова; Мария Каменева), 3: 57.36.
5. Нидерланды (Кира Туссен; Тес Схоутен; Маике де Ваард; Фемке Хеемскерк), 3: 59.89.
6. Беларусь (Анастасия Шкурдай; Алина Змушка; Анастасия Кулишова; Настасья Караковская), 4:00.49.
7. Гонконг (Вонг Тото Кван То; Йунг Джейми Чжен Мей; Хоги Шобхан Бернадетт; Ченг Камилла Лили Мей), 4: 02.86.
8. Дания (Каролин Эневольд Соеренсен; Клара Рыбак-Андерсен; Эмили Бекманн; Сигне Бро), 4: 04.04.
Авторские права © 2021 г. Все права защищены. Этот веб-сайт не предназначен для пользователей, находящихся в Европейской экономической зоне.
Летние Олимпийские игры 1996 года | |||
Волейбол, мужчины | Российская Федерация | 4 | |
Олег Шатунов • Вадим Хамутцких • Сергей Орленко • Руслан Олихвер • Алексей Казаков • Дмитрий Фомин • Сергей Тетюхин • Павел Шишкин • Константин Ушаков • Станислав Динейкин • Игорь Шулепов • Валерий Горюшев | |||
Волейбол, женщины | Российская Федерация | 4 | |
Валентина Огиенко • Наталия Морозова • Марина Панкова • Елена Батухтина • Ирина Ильченко • Лена Година • Татьяна Меньшова • Евгения Артамонова • Елизавета Тищенко • Юлия Тимонова • Татьяна Грачева • Любовь Соколова | |||
Летние Олимпийские игры 2000 | |||
Волейбол, мужчины | Российская Федерация | 2 | Серебро |
Игорь Шулепов • Валерий Горюшев • Александр Герасимов • Роман Яковлев • Алексей Казаков • Вадим Хамутцких • Алексей Кулешов • Евгений Митков • Руслан Олихвер • Илья Савельев • Сергей Тетюхин • Константин Ушаков | |||
Волейбол, женщины | Российская Федерация | 2 | Серебро |
Анастасия Беликова • Елизавета Тищенко • Инесса Саркисян • Любовь Шашкова • Наталия Морозова • Ольга Поташова • Татьяна Грачева • Екатерина Гамова • Лена Година • Елена Тюрина • Елена Василевская • Евгения Артамонова | |||
Летние Олимпийские игры 2004 года | |||
Волейбол, мужчины | Российская Федерация | 3 | бронза |
Павел Абрамов • Сергей Баранов • Станислав Динейкин • Алексей Казаков • Вадим Хамутцких • Тарас Хтей • Александр Косарьев • Алексей Кулешов • Сергей Тетюхин • Константин Ушаков • Алексей Вербов • Андрей Егорчев | |||
Волейбол, женщины | Российская Федерация | 2 | Серебро |
Ирина Тебенихина • Елена Тюрина • Любовь Шашкова • Евгения Артамонова • Елизавета Тищенко • Ольга Чуканова • Екатерина Гамова • Марина Шещенина • Елена Плотникова • Ольга Николаева • Александра Коруковец (DNS) | |||
Летние Олимпийские игры 2008 | |||
Волейбол, мужчины | Российская Федерация | 3 | бронза |
Александр Волков • Алексей Вербов • Сергей Тетюхин • Семен Полтавский • Алексей Остапенко • Максим Михайлов • Алексей Кулешов • Александр Косарьев • Александр Корнеев • Вадим Хамутцких • Сергей Гранкин • Юрий Бережко | |||
Волейбол, женщины | Российская Федерация | = 5 | |
Марина Шешенина • Любовь Шашкова • Александра Пасынкова • Юлия Меркулова • Екатерина Кабешова • Лена Година • Екатерина Гамова • Ольга Фатеева • Евгения Эстес • Мария Бородакова • Наталия Алимова • Марина Акулова | |||
Летние юношеские Олимпийские игры 2010 | |||
Волейбол, мальчики | Российская Федерация | 3 | бронза |
Иван Комаров • Филипп Мокиевский • Валентин Голубев • Илья Никитин • Александр Щурин • Вадим Золотухин • Максим Куликов • Алексей Тертышников • Богдан Гливенко • Владимир Манеров • Константин Осипов • Дмитрий Солодилин | |||
Летние Олимпийские игры 2012 | |||
Волейбол, мужчины | Российская Федерация | 1 | Золото |
Николай Апаликов • Тарас Хтей • Сергей Гранкин • Сергей Тетюхин • Александр Соколов • Юрий Бережко • Александр Бутко • Дмитрий Мусэрский • Дмитрий Ильиных • Максим Михайлов • Александр Волков • Алексей Обмочаев | |||
Волейбол, женщины | Российская Федерация | = 5 | |
Мария Борисенко • Мария Перепёлкина • Евгения Эстес • Любовь Шашкова • Анна Матиенко • Светлана Крючкова • Наталия Обмочаева • Екатерина Гамова • Евгения Старцева • Екатерина Уланова • Татьяна Кошелевка 40 • Юлия | |||
Летние Олимпийские игры 2016 | |||
Волейбол, мужчины | Российская Федерация | 4 | |
Алексей Вербов • Александр Волков • Сергей Гранкин • Максим Михайлов • Андрей Ащев • Артем Ермаков • Артем Вольвич • Дмитрий Волков • Егор Клюка • Игорь Кобзарь • Константин Бакун • Сергей Тетюхин | |||
Волейбол, женщины | Российская Федерация | = 5 | |
Татьяна Кошелева • Наталия Гончарова • Анастасия Самойленко • Анна Малова-Подкопаева • Дарья Малыгина • Екатерина Косьяненко • Елена Ежова • Яна Щербань • Ирина Фетисова • Ирина Воронкова • Ирина Заряжко-Королева 900 |
Ирина Тюрина — факты, биография, карьера, собственный капитал
В школе Ирина Нельсон открыла для себя джаз.Студентка настолько увлеклась этим направлением, что даже стала солисткой джазового оркестра, который был сформирован при школе. Но вскоре молодой певец «перерос» эту группу и решил двигаться дальше.
Ира создала собственный коллектив, в репертуаре которого много песен собственного сочинения. Джазовый биг-бэнд начал гастролировать по стране. Но после музыкального конкурса «Ялта-91», где новосибирская певица заняла 1 место, она покинула группу. Терешина не смогла отказаться от предложения композитора Вячеслава Тюрина.Он увидел в Ялте талантливую девушку и предложил ей работать в группе «Электроверсия». Конечно, она согласилась. Это был карьерный скачок, обещавший превратить малоизвестную певицу в звезду.
Так и случилось. Ира Терешина стала известной исполнительницей Дианой. В первый год сотрудничества с Тюриным певица записала свой первый диск под названием «Вечер с Дианой».
Альбомы Дианы выходили один за другим и пользовались значительным успехом. В период с 1991 по 1999 год было выпущено 7 альбомов певицы.Лучшие из них — «Я хочу любить», «Я вернусь» и «Не рассказывай». В это время Диана активно гастролирует, часто за границей. В 1993 году артист посетил Каннский музыкальный фестиваль. Позже она приняла участие в песне года в США.
Свои первые престижные награды Диана получила в 1996 году. Студия «Союз» вручила ей Золотой диск.
В конце 1990-х в жизни певца произошел крутой поворот. Вышла замуж и уехала в Германию. Собственно, именно тогда и родилась Ирина Нельсон.Мужем певицы стал гражданин Швеции Андреас Нельсон. Россиянка взяла его фамилию в качестве сценического псевдонима.
В Германии российский певец познакомился с Дитером Боленом и ди-джеем Бобо. Они повлияли на ее дальнейшее творчество. Однако, как и ее муж, он музыкант, путешественник, буддист и приверженец восточной культуры.
После недолгого замужества певица вернулась на родину. Здесь артистка продолжила сотрудничество с Вячеславом Тюриным.
Композитор приветствовал новое направление, которое исполнительница решила привнести в свое творчество.Она хотела создать новый проект, который был бы ориентирован не только на танцполы, но и на слушателей «непредвзято». Вероятно, здесь повлияли буддийские практики, с которыми Ирина Нельсон познакомилась в зарубежный период своей жизни.
Так появилась группа Reflex в 1999 году. Впервые название прозвучало от близкого друга певца — стилиста Алишера. В переводе с латинского «отражение» означает «отражение». Этого и хотела Ирина Нельсон — показать свой внутренний мир.
Дебютная песня «Reflex», получившая название «High Light», стала хитом.Она заняла первые строчки хит-парадов радио «Европа Плюс». А второй хит, композиция Go Crazy, побил все рекорды. В 2001 году всего за неделю она поднялась на 1 место в хит-парадах «Русского радио».
В конце лета 2003 года группа компаний Reflex выходит на международный уровень. Вместе с группой «Тату» она представляла страну в Кельне, Германия, на международном фестивале Pop Сomm.
А в декабре 2005 года «Рефлекс» вошел в пятерку самых любимых поп-групп россиян по результатам голосования, проведенного Международным агентством талантов.В том же году хит «Танцы» вошел в тройку победителей «Золотого граммофона». За эти годы группа выпустила ряд клипов, завоевавших популярность у зрителей музыкальных каналов — «Первый раз», «Я всегда буду ждать тебя», «Звезды упали», «Любовь».
Ира задумала — создать команду, которая будет выпускать хиты для танцполов — получилось. В 2006 году «Московский комсомолец» признал Reflex лучшим танцевальным проектом года. Певец и композитор Вячеслав Тюрин удостоен государственных наград.
И снова популярная исполнительница на пике славы делает крутой поворот в карьере. Творческая биография Ирины Нельсон в самом начале 2007 года получает новую главу. Певица начинает сольную карьеру. В январе она вместе с композитором и мужем Вячеславом Тюриным отправилась в Дубай. Тюрин возглавлял многопрофильную музыкальную студию, записывающую ближневосточную и европейскую рок- и поп-музыку. Еще одно направление — запись и создание саундтреков для кино.
Сама певица провела два года под наблюдением врачей в клинике в горах Фуджейры, так как переутомление сказалось на ее здоровье.В начале осени 2008 года поклонники певицы обрадовались ее возвращению после тайм-аута. В перерыве артистка готовила новый материал для сольной карьеры. Теперь это был совсем другой уровень. Первые 2 сингла были записаны на лондонской студии Air Studio, которая принадлежит бывшему продюсеру Beatles Джорджу Мартину. Продюсерами новых песен поп-звезды стали два человека — все те же Вячеслав Тюрин и Стив Орчард, которые в свое время работали с такими звездами, как Пол Маккартни, Питер Гэбриел и Стинг.
Помимо работы в группе Reflex, артистка продолжила сольную работу. В 2009 году Ирина выпустила хит «Заря», за ним последовали музыкальные композиции «Восход», «Теплое солнце». В 2014 году вместе с Денисом Клявером записал песню и клип «Я молюсь за тебя». Но «Рефлекс» также продолжал радовать поклонников новыми хитами, среди которых были песни «Артист», «Прикосновения», «Взрослые девушки».
В 2016 году Ирина Нельсон подарила поклонникам новую песню «Talk to Me». Помимо песен на русском и английском, певица заинтересовалась исполнением мантр, которые она записывала для занятий йогой.Публике настолько понравились эти песнопения, что Ирина вместе с этническим музыкантом Владимиром Мурановым дала концерт.
60-е ежегодное собрание биофизического общества
2318-Pos Board B462 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНДУЦИРОВАННОГО СВЕТОМ НЕЙРОБЛАСТОМЫ НА КЛЕТКИ N2A С ПАРКИНСОНОВЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ. Ленка Коптасикова, Вероника Хунтосова, Эммануэль Герелли, Павол Мисковский, Жорж Ваньерес, Катарина Строфекова 2319-Pos Board B463 ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ АЛЬФА-СИНУКЛЕИНА В РЕГУЛИРОВАНИИ СИНТЕЗА АТФ.Марта Людтманн, Пламена Ангелова, Наталья Нинкина, Соня Ганди, Владимир Бухман, Андрей Абрамов 2320-Pos Board B464 МЕМБРАННО-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ПЕПТИД ИНГИБИРУЕТ БЛОКИРОВАНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО VDAC АЛЬФА-СИНУКЛЕНОМ: В ПОИСКЕ A-SYNUCLEIN. Филипп Гурнев, Дэвид Хугерхайде, Татьяна Ростовцева, Сергей Board B465 ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-СИНУКЛЕИНОВЫХ МУТАЦИЙ НА МИТОХОНДРИАЛЬНУЮ ДИСФУНКЦИЮ, ЗАВИСИМЫЕ ОТ ШТАММА. Минни Л. Чой, Чжи Яо, Лаура Тосатто, Дэвид Кленерман, Андрей Ю. Абрамов, Соня Ганди 2322-Pos Board B466 МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС С ПОМОЩЬЮ ФОТОТЕРМИЧЕСКОГО НАНОБЛАДА ВОССТАНАВЛИВАЕТ ДЫХАНИЕ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ДИСФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ МИТОХОНАМИ.Александр Н. Патананан, Тинг-Сян Ву, Энрико Сагулло, Дана Кейс, Синь Чжэн, Янцзин Ли, Джейсон С. Хонг, Тара Теслаа, Дж. Майкл Маккаффери, Кайван Ниази, Даниэль Браас, Карла М. Кёлер, Томас Г. Гребер , Пей-Ю Чиу, Майкл А. Тейтелл 2323-Pos Board B467 ОТДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ НУКЛЕОИДОВ, ВИЗУАЛИЗИРОВАННОЕ BIPLANE FPALM / DSTORM. Петр Езек, Томаш Спейсек, Лукас Алан 2324-Pos Board B468 ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ ИЗМЕРЕНИЯ ПЕРИКЛЕТОЧНОГО КИСЛОРОДА. Лирон Бойман, Джозеф П. И. Као, Дженни Б. Лич, У. Джонатан Ледерер, Джордж С.B. Williams 2325-Pos Board B469 МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДИНАМИКИ. Дэвид Уивер, Анико Гал, Дьердь Хайноцки 2326-Pos Board B470 ЭЛАСТОКАПИЛЛЯРНАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ПРИ МИТОХОНДРИАЛЬНОМ ДЕЛЕНИИ. Дэвид Гонсалес-Родригес, Себастьен Сарт, Авин Бабатахери, Дэвид Таресте, Абдул И. Баракат, Кристоф Кланет, Жюльен Хассон Совет 2327-Pos B471 МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ NM23-h5 / NDPK-D ПОДДЕРЖИВАЕТ СИГНАЛИЗАЦИОННЫЙ СИГНАЛ КАРДИОЛИПИНА ДЛЯ СИГНАЛИЗАЦИИ ДИАГНОЛИПИНА КАРДИОЛИПИНА. Уве Шлаттнер, Цзяньфэй Цзян, Чжентаи Хуанг, Юлия Ю.Тюрина, Селин Десбурд, Сесиль Котте-Руссель, Хайдер Дар, Маниш Верма, Владимир А. Тюрина, Александр А. Капралов, Мари-Лиз Лакомб, Шарлин Т. Чу, Рама Маллампалли, Хюля Байр, Валериан Э. Каган 2328-Pos Board B472 РОЛЬ ЛИПИДОВ В РЕГУЛЯЦИИ ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ СМЕРТИ КЛЕТОК. Мартин Лидман, Артур Дингельдейн, Шарка Покорна, Радек Шахл, Тобиас Спаррман, Мартин Хоф, Герхард Гребнер 2329-Pos Board B473 МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СПОРАДИЧЕСКОГО ПАРКИНСОНИЗМА: РОЛЬ 18 KDA PROTEIN TSPO. Мишель Фрисон, 2330-Pos Board B474 CPOW TRAVEL AWARDEE РЕГУЛИРОВАНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА ТРАНСЛОКАТОРА 18KDA (TSPO).Джемма Л. Гатлифф, Даниэль Ист, Федерико Туркхаймер, Микеланджело Кампанелла Безруков 2321-Pos
2304-Pos Board B448 ГЕТЕРОГЕННАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА, ВЫЯВЛЕННАЯ С ПОМОЩЬЮ ЖИВЫХ ОДНОКЛЕТЧАТЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ. Захари Т. Бэрри, Итан Гарнер, Марк Батх 2305-Pos Board B449 Грубое моделирование ВЫЯВЛЯЕТ МЕХАНИЗМЫ БАКТЕРИАЛЬНОГО МОРФОГЕНЕЗА. Лам Т. Нгуен, Мэтью Суулиус, Джеймс С. Гамбарт, Морган Биби, Грант Дж. Дженсен 2306-Pos Board B450 МОЖЕТ ЛИ ESCHERICHIA COLI SENSE SENSE SENSE SENSE SENSE SPATIAL? Рича Кармакар, Махеш С.Тирумкудулу, К. В. Венкатеш 2307-Pos Board B451 НАТРИЕВОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ЭНЕРГИИ ДЛЯ ФЛАГЕЛЛЯРНОГО ВРАЩЕНИЯ САМОГО РАННЕГО ДИВЕРГЕНТА ГИПЕРТЕРМОФИЛЬНОГО БАКТЕРИЯ. Норихико Такекава, Масаёси Нишияма, Цуёси Канезеки, Тамоцу Канаи, Харуюки Атоми, Сейдж Кодзима, Michio Homma 2308-Pos Board B452 СИЛОВАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО АДГЕЗИНА С ВНУТРЕННЕЙ ТИОЭФИРНОЙ СВЯЗЬЮ. Даниэль Эчельман, Хулио Фернандес 2309-Pos Board B453 АРХИТЕКТУРА МАШИНЫ ТИПА IVA PILUS. И-Вей Чанг, Ли Реттберг, Анке Тройнер-Ланге, Джанет Иваса, Лотте Согаард-Андерсен, Грант Йенсен, доска 2310-Pos B454 ПЛАВАНИЕ НЕФЛАГЕЛЛИРОВАННОГО БАКТЕРИЯ НЕВРАЩАТЕЛЬНЫМ МОЛЕКУЛЯРНЫМ ДВИГАТЕЛЕМ.Маттиас Кох, Джулиан Рот, Александр Рорбах 2311-Pos Board B455 ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФЛАГЕЛЛЯРНЫХ ДВИГАТЕЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ МАГНИТНОГО ДИНАМИЧЕСКОГО КЛЮЧА. Ильонг Юнг, Маартен М. ван Оене, Nynke Board B456 УПРУГИЕ СВОЙСТВА МАГНИТОСОМНЫХ ЦЕПЕЙ. Бахаре Киани, Дэмиен Фейвр, Стефан Клумпп 2313-Pos Board B457 СИЛЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ УПРАВЛЯЮТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ СОРТИРОВКОЙ И СТАБИЛЬНОСТЬЮ В РАННИХ БИОПЛЕНКАХ. Лена Девентер, Энно Р. Олдевуртел, Надзея Кузель, Торстен Фолькманн, Катя Хенселер, Беренике Майер 2314-Pos Board B458 ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ МЕХАНИЧЕСКИЕ РОЛИ ДЛЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПОЛИМЕРОВ В ИНИЦИАЦИИ И ПРОЧНОСТИ БИОФИЛЬМОВ.Вернита Гордон, Кристофер Родесни, Би Джей Кули, Кристин Ковач, Меган Дэвис-Филдс «Жизнь и смерть митохондриальных клеток» (платы B459 — B484) Доска с 2315 позициями B459 ТЕМНЫЙ ГИПЕРИЦИН ВЛИЯЕТ НА НЕСКОЛЬКО ПОДКЛЕТОЧНЫХ УРОВНЕЙ. Катарина Строффекова, Вероника Хунтосова, Марта Новотова, Зузана Ничтова, Тибор Козар, Павол Мисковский 2316-Pos Board B460 ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ МОРФОЛОГИЕЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬЮ ПОСЛЕ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА. Зузана Надова, Ленка Ленкавска, Александра Фрагола, Стефани Бонно, Франк Сюро, Павол Мисковский 2317-Pos Board B461 ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС И АКТИВАЦИЯ JNK ВЫЗЫВАЮТ МИТОХОНДРИАЛЬНУЮ ДИСФУНКЦИЮ И КЛЕТОЧНУЮ СМЕРТЬ ПРИ ГЕПАТОКАРЦИНОМ-АНТУБОДУБЕ.Эдуардо Мальдонадо, Дэвид Н. ДеХарт, Диана Фанг, Карим Хеслоп, Моника Бек Гуз, Джон Лемастерс Х. Деккер 2312-Поз.
Т У
E S
Д А И
124
Динамика развития компенсации дозировки Х-хромосомы с помощью DCC и h5K20me1 у C. elegans
Цитирование: Крамер М., Кранц А.Л., Су А., Винтеркорн Л.Х., Альбриттон С.Е., Эркан С. (2015) Динамика развития Х-хромосомы Компенсация дозировки DCC и h5K20me1 в C . elegans . PLoS Genet 11 (12): e1005698. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698
Редактор: Эрика Ларшан, Университет Брауна, США
Поступила: 7 мая 2015 г .; Принята к печати: 3 ноября 2015 г .; Опубликовано: 7 декабря 2015 г.
Авторские права: © 2015 Kramer et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника
Доступность данных: Данные доступны на Gene База данных Expression Omnibus (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под регистрационным номером [GSE67650].
Финансирование: Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук, грант R01GM107293. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Введение
Дозовая компенсация уравнивает экспрессию гена Х-хромосомы между полами.Разные животные используют разные стратегии дозовой компенсации, кооптируя различные механизмы регуляции генов Х-хромосомы [1]. У млекопитающих дозовая компенсация транскрипционно инактивирует одну из двух X-хромосом у XX женщин, чтобы уравнять общую экспрессию X с экспрессией XY мужчин. У Drosophila melanogaster X-хромосома транскрибируется в два раза выше у самцов XY. В Caenorhabditis elegans дозовая компенсация репрессирует обе Х-хромосомы наполовину у гермафродитов ХХ, выравнивая общие уровни транскриптов Х-хромосомы с таковыми у мужчин ХО.
Дозовая компенсация хромосомыX устанавливается во время и важна для развития у млекопитающих, D . melanogaster и C . elegans . У мышей неактивность X приводит к постоянному ухудшению состояния эмбриона и смерти примерно через 10 дней после полового акта [2–4]. В D . melanogaster , комплекс дозовой компенсации (мужской специфический летальный комплекс (MSL)) локализуется в Х-хромосоме на стадии поздней бластодермы / ранней гаструлы [5,6].Мутации в любом из четырех членов комплекса MSL замедляют развитие и приводят к летальности на поздних личиночных и ранних стадиях куколки [7–9]. В C . elegans , мутации в нескольких субъединицах комплекса дозовой компенсации (DCC) являются летальными по материнскому эффекту, когда потомство гомозиготных нуль-мутантных червей погибает на ранних личиночных стадиях [10–12].
Инактивация X млекопитающих, D . melanogaster MSL и комплекс C . elegans DCC все регулируют структуру хроматина Х-хромосомы [1,13].У млекопитающих инактивация X приводит к обогащению различных модификаций гетерохроматических гистонов на неактивном X [14,15]. В D . melanogaster , комплекс MSL увеличивает ацетилирование h5K16 на мужской Х-хромосоме через его субъединицу гистонацетилтрансферазы MOF [16,17]. В C . elegans , связывание DCC необходимо для обогащения h5K20me1 и истощения h5K16ac на Х-хромосомах у гермафродитов [18,19]. Хотя несколько модификаций гистонов связаны с дозовой компенсацией, неясно, действуют ли эти гистоновые модификации как нижестоящие эффекторы комплексов дозовой компенсации.
В C . elegans , ядро из пяти субъединиц DCC представляет собой конденсиновый комплекс, названный конденсином I DC (далее конденсин DC) [20]. Condensin DC взаимодействует с дополнительными белками, которые играют роль в гермафродитах и X-специфическом рекрутировании DCC в X хромосомы [21-24]. Конденсины представляют собой эволюционно законсервированные белковые комплексы, которые необходимы для конденсации и сегрегации хромосом во время деления клеток (см. Обзор [25]). У многоклеточных животных есть два типа конденсинов, названные конденсином I и II.В C . elegans , конденсин DC отличается от конденсина I одной субъединицей, DPY-27 [20]. В отличие от конденсина DC, конденсин I и II связываются со всеми хромосомами [20,26]. В C . elegans , нокдаун специфической субъединицы конденсина II KLE-2 подтвердил, что конденсин II также является репрессивным [26]. Конденсины участвуют в регуляции транскрипции у др. Организмов, но молекулярные механизмы, с помощью которых конденсины регулируют транскрипцию, остаются неизвестными (rev. [27]).
С . elegans DCC представляет собой четкую парадигму для изучения механизмов регуляции транскрипции с помощью конденсинов. DCC начинает локализоваться в Х-хромосомах гермафродита примерно на стадии 40 клеток (Рис. 1A) [22,28]. Связывание DCC приводит к обогащению h5K20me1 на X, которое начинается примерно на стадии 100 клеток [18,29]. Здесь мы проанализировали компенсацию дозировки Х-хромосомы во время C . elegans путем сравнения экспрессии генов между полами и мРНК-seq в мутантах dpy-27, (субъединица конденсина DC) и dpy-21 (член DCC без конденсина).Наши результаты подтверждают, что конденсин DC запускает репрессию, поскольку он локализуется в X хромосомах у ранних эмбрионов (стадия 4-40 клеток). Различия в экспрессии генов между мутантами dpy-21 и dpy-27 подтверждают дополнительную независимую от DCC роль для dpy-21 , подчеркивая, что конденсиновый дроссель DC и неконденсиновые члены DCC функционально различаются. Чтобы прояснить роль h5K20me1 в компенсации дозировки Х-хромосомы, мы провели анализ ChIP-seq мРНК-seq и h5K20me1 у мутантных червей set-1 (h5K20 монометилаза) и set-4 (h5K20 ди — / — триметилаза). .Наши результаты предполагают, что уровни h5K20me1 важны для компенсации дозировки Х-хромосомы, но h5K20me1 сам по себе не действует как нижестоящий эффектор DCC.
Рис. 1. Х-хромосома не полностью компенсируется дозой в раннем эмбриогенезе.
(A) Хронология регуляции Х-хромосомы во время эмбриогенеза C. elegans. Зиготическая транскрипция начинается на стадии четырех клеток [100,101], за которой следует экспрессия генов детерминации пола на стадии 28 клеток [32]. Это запускает локализацию DCC в X-хромосомах примерно на стадии 40 клеток [21,22,28] и обогащение h5K20me1 на X хромосоме, начиная со стадии 100 клеток [18].(B) значения экспрессии мРНК-seq от гермафродитов (ось y) и смешанного пола (ось x) ранних эмбрионов (стадия 4-40 клеток) были нанесены на график. X показан фиолетовым цветом и немного смещен в сторону гермафродитных данных. (C) Коробчатая диаграмма показывает распределение логарифмической разницы в 2 раз между гермафродитами и ранними эмбрионами смешанного пола. Горизонтальные линии указывают на одинаковую экспрессию между полами (log 2 -кратное различие = 0) и в 2-кратное увеличение экспрессии у гермафродитов (log 2 -кратное различие = 0.415). Числа n под полями показывают количество экспрессируемых генов для каждой хромосомы. По сравнению с каждой из аутосом экспрессия Х-хромосомы значительно выше у гермафродитов (односторонний критерий суммы рангов Вилкоксона, *** = p <10 -3 , ** = p <10 -2 и * = р <0,05.). (D) Дифференциально экспрессируемые гены (DESeq padj <0,05) были разделены на три группы: повышенная (более высокая) или отрицательная регуляция (более низкие уровни транскриптов) у гермафродитов, и не экспрессируются дифференциально.Распределение этих групп по хромосомам указывает на значительное обогащение генов, активируемых гермафродитами, на Х-хромосоме (точный тест Фишера для обогащения, *** = p <10 -3 , ** = p <10 -2 ). (E) Графики показывают процент статистически сходно выраженных транскриптов (см. Методы), депонированных от матери (FPKM ооцита> 1 [30]).
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.g001
Результаты
Х-хромосома не полностью компенсируется дозой во время раннего эмбриогенеза
Мы измерили дозовую компенсацию Х-хромосомы у ранних эмбрионов, когда зиготическая транскрипция активна, но DCC еще не полностью локализован в Х-хромосоме.Здесь мы измерили дозовую компенсацию гена как соотношение уровней его мРНК между гермафродитами и самцами. Мы создали наборы данных мРНК-seq из 2–5 биологических повторов (файл S1), которые сильно коррелировали (рис. S1). Из-за сложности получения чистых мужских популяций до начала экспрессии генов, специфичных для пола, мы сравнили эмбрионы гермафродитов (XX) с эмбрионами смешанного пола (XX и XO). Эмбрионы смешанного пола были выделены путем скрещивания самцов и гермафродитов облигатного ауткроссинга ( fog-2 (oz40) ), чтобы обеспечить 50% мужской популяции.«Ранние эмбрионы» находятся между 4- и 40-клеточными стадиями (S2 Рис). На этой стадии активируется зиготическая транскрипция, и DCC начинает локализоваться, но не полностью обогащается на Х-хромосоме во всех клетках (Рис. 1A) [22,29].
У ранних эмбрионов экспрессия Х-хромосомы была выше у гермафродитов по сравнению со смешанным полом (Рис. 1B). Среднее log 2 соотношение экспрессии между гермафродитными и смешанными половыми эмбрионами было значительно выше на X (0,182) по сравнению с аутосомами (колеблется от 0.От 034 до 0,052) (рис. 1C, односторонний критерий суммы рангов Вилкоксона p <1,77 x 10 -9 ). Кроме того, гены со значительно более высокой экспрессией у гермафродитов были обогащены по X (рис. 1D, точный тест Фишера p = 3,12×10 -6 ). Таким образом, Х-хромосома не полностью дозированно компенсируется между полами у ранних эмбрионов, но транскрипты Х-хромосомы довольно схожи между полами, поскольку наблюдаемое медианное значение коэффициента экспрессии log 2 0,182 меньше ожидаемого, если бы экспрессия X была в два раза выше у эмбрионов. XX гермафродитных эмбрионов в сравнении XX / смешанный пол (0.411).
Материнская нагрузка помогает уравновесить дозу гена Х-хромосомы между полами в раннем эмбриогенезе
Одним из механизмов, который может уравнять уровни транскрипта Х-хромосомы между полами, является загрузка мРНК материнской мРНК в ооциты. Чтобы проверить это, мы спросили, загружены ли аналогично экспрессируемые гены материнской нагрузкой. Хотя большинство методов идентифицируют гены, которые по-разному экспрессируются между полами, отсутствие дифференциальной экспрессии не показывает, что гены статистически экспрессируются одинаково.Мы идентифицировали 780 генов, которые статистически одинаково экспрессируются между гермафродитными и смешанными половыми ранними эмбрионами, взяв гены, которые показывают разницу в экспрессии менее 30% в пределах 95% доверительного интервала (полное объяснение см. В разделе «Материалы и методы»). Среди 36 сходно экспрессируемых генов Х-хромосомы 35 были загружены от матери (FPKM> 1 в ооцитах [30]). Примерно 95% сходно экспрессируемых генов на аутосомах также были загружены материнским организмом, таким образом, материнская загрузка транскриптов в ооциты помогает уравнять дозировку генов между гермафродитными и мужскими эмбрионами (рис. 1E).
Дозовая компенсация экспрессии зиготического гена во время раннего эмбриогенеза
Чтобы конкретно изучить дозовую компенсацию экспрессии зиготических генов, мы идентифицировали гены, которые не экспрессируются в эмбрионах на двухклеточной стадии, но вновь экспрессируются в ранних эмбрионах. K-означает кластеризацию экспрессии между ранее опубликованными данными экспрессии в 2-клеточных гермафродитных эмбрионах [30] и нашими данными для ранних эмбрионов, что привело к пяти отчетливым кластерам (Fig 2A). Гены в кластере 3 являются зиготическими, потому что они демонстрировали небольшую экспрессию или ее отсутствие в 2-клеточных эмбрионах и повышенную экспрессию в ранних эмбрионах (Рис. 2B).Поскольку мы не можем различить стабильные и вновь транскрибируемые мРНК, гены в оставшихся кластерах также могут быть зиготически экспрессированы. Таким образом, чтобы изучить зиготическую экспрессию, мы сосредоточились на вновь экспрессируемых генах (кластер 3). Экспрессия гермафродитов в Х-хромосоме была значительно выше по сравнению с аутосомами (односторонний критерий суммы рангов Вилкоксона, p = 0,019), но разница была меньше ожидаемой, если не было дозовой компенсации. Следовательно, ранняя зиготическая экспрессия от X компенсируется дозировкой, но не полностью (Рис. 2C).
Рис. 2. DCC подавляет зиготическую экспрессию Х-хромосомы у ранних эмбрионов.
(A) K означает кластеризацию экспрессии в двухклеточных [30] и ранних гермафродитных эмбрионах (4-40 клеток). Из пяти идентифицированных кластеров один показал явно повышенную экспрессию между двухклеточными и ранними эмбрионами (№3). (B) Коробчатые диаграммы показывают уровни экспрессии генов, разделенных кластерами в двухклеточных [30] и ранних гермафродитных и смешанных половых эмбрионах. (C) Недавно экспрессированные гены были идентифицированы путем взятия генов в кластере № 3, которые не показали экспрессии в двухклеточных эмбрионах (FPKM <1).Коробчатые диаграммы показывают распределение различий в экспрессии между полами у ранних эмбрионов. Как вновь экспрессированные, так и все экспрессированные (FPKM> 1) гены были значительно выше в хромосомах гермафродита X по сравнению с аутосомами (односторонний критерий суммы рангов Вилкоксона, *** = p <10 −3 , * = p <0,05) (D) Уровень экспрессии генов раннего определения пола у гермафродитов и образцов смешанного пола показан для указанных наборов данных. Данные по экспрессии на 2-клеточной стадии у гермафродитных эмбрионов были получены из [30].Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего. (E) Log 2 соотношений экспрессии между dpy-27 (y56) и N2 дикого типа демонстрируют значительную дерепрессию X у dpy-27 (y56) ранних эмбрионов. dpy-27 (y56) мутация влияет на экспрессию вновь экспрессируемых зиготических генов (панель C) на Х-хромосоме по сравнению с аутосомами. Достоверность активации X тестировали с использованием одностороннего критерия суммы рангов Вилкоксона (*** = p <10 -3 ).
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1005698.g002
Экспрессия генов детерминации пола в раннем эмбриогенезе
В C . elegans , неполная дозовая компенсация у ранних эмбрионов логична, поскольку пол определяется соотношением X и аутосомных половых элементов (XSEs и ASEs) [31–33]. У ранних эмбрионов мы наблюдали, что специфический для мужчин ген her-1 экспрессируется в 11,2 раза выше в выборках смешанного пола по сравнению с гермафродитами (рис. 2D). Это соответствует примерно в 17 раз более высокой экспрессии у мужчин, что согласуется с предыдущими измерениями ~ 20-кратной разницы в экспрессии her-1 между мужчинами и гермафродитами [34].Интересно, что транскрипт гена xol-1 , стимулирующего самец, был лишь немного выше в выборках смешанного пола (рис. 2D). Возможно, что разница в уровне эндогенного транскрипта xol-1 между полами меньше, чем для трансгенов [35]. Также возможно, что X-связанный xol-1 репрессируется DCC у ранних эмбрионов, поскольку dpy-27 начинает репрессировать Х-хромосомы у ранних эмбрионов (рис. 2E), а xol-1 было показано, что он подавляется DCC [36].Мы также обнаружили, что уровни мРНК как XSE, так и ASE были выше у гермафродитов, предполагая, что дозировка XSE и ASE не зависит от простого соотношения уровней мРНК между полами (S3, рис.). Вместо этого небольшие и временные различия в транскрипции XSE, ASE и xol-1 могут быть усилены посттранскрипционно, чтобы в конечном итоге регулировать экспрессию her-1 , которая явно выше у мужчин (Рис. 2D).
DPY-27 репрессирует хромосомы гермафродита X в раннем эмбриогенезе
DCC связан с определением пола через sdc-2 , который специфически экспрессируется в эмбрионах гермафродитов [22].SDC-2 необходим для локализации DCC в X и репрессии специфичного для мужчин гена her-1 [37]. Недавнее исследование показало, что у эмбрионов на стадии 50 клеток половина клеток содержит DPY-27 специфически на Х-хромосомах [29]. В наших ранних коллекциях эмбрионов (стадия 4-40 клеток) sdc-2 более высоко экспрессируется у гермафродитов, а her-1 экспрессируется у самцов, следовательно, DCC активируется (Fig 2D). Чтобы проверить, подавляет ли DCC экспрессию X-хромосомы вскоре после локализации в X, мы собрали dpy-27 нулевых мутантных эмбрионов, используя штамм с генетически сбалансированным аллелем (y56) (Материалы и методы).У ранних эмбрионов нулевая мутация dpy-27 и вызвала значительную дерепрессию вновь транскрибированных зиготических генов на X (рис. 2E), предполагая, что dpy-27 репрессирует X-хромосомы в ранних эмбрионах. Dpy-27 не обнаруживается в зародышевой линии гермафродитов XX с помощью иммуноокрашивания, но он депонируется у матери и необходим для развития [38-40]. Таким образом, мы интерпретируем наблюдаемый эффект нулевой мутации dpy-27 , исходящий от эмбрионов, которые загрузили DCC на Х-хромосомы в некоторых клетках на стадии 40 клеток.Это означает, что DCC способен быстро репрессировать Х-хромосомы после загрузки.
Компенсация дозировки Х хромосомы во время развития
Чтобы определить, выравнивается ли средняя экспрессия Х-хромосомы между полами и когда, мы проанализировали дополнительные временные точки, включая эмбрионы на стадии запятой, стадии личинки L1 и L3 и молодых взрослых особей. На стадии запятой экспрессия Х-хромосомы оставалась немного, но значительно выше у гермафродитов по сравнению с червями смешанного пола (рис. 3А). У личинок L1, L3 и молодых особей средняя экспрессия Х-хромосомы больше не была выше у гермафродитов.Помимо измерения дозовой компенсации в каждый момент времени, для каждого гена мы также рассчитали изменение дозовой компенсации между двумя последовательными временными точками. От ранней стадии до стадии запятой Х-хромосома была слегка репрессирована, но экспрессия гена Х-хромосомы стала значительно более сбалансированной между полами после стадии запятой (рис. 3B, сумма рангов Вилкоксона p = 1,13 x 10 -63 ). Чтобы выяснить, компенсируется ли дозировка большего количества генов после стадии запятой, мы определили статистически сходно экспрессируемые гены на каждой стадии развития.Процент генов Х-хромосомы, которые были статистически одинаково выражены между полами, увеличивался от ранней стадии до эмбриона на стадии запятой (4,6% до 12,8% соответственно) и оставался на аналогичных уровнях у L1, L3 и молодых людей (10,3%, 10,4%, 13,5% соответственно). %, соответственно). Таким образом, в среднем больше генов Х-хромосомы репрессируется после стадии запятой (рис. 3В), но доля эквивалентно экспрессируемых генов Х-хромосомы увеличивается после раннего эмбриогенеза.
Рис. 3. Большинство генов Х-хромосомы компенсируются дозами после стадии эмбриогенеза через запятую.
(A) Коробчатая диаграмма показывает распределение log 2 -кратных различий уровней мРНК между гермафродитами и червями смешанного пола для ранних эмбрионов, эмбрионов на стадии запятой, личинок L1, личинок L3 и молодых взрослых особей. Горизонтальные линии показывают соотношение, ожидаемое для равной и вдвое большей экспрессии у гермафродитов. Повышенную экспрессию X тестировали между X и аутосомами с помощью одностороннего критерия суммы рангов Вилкоксона (*** = p <10 -3 ). (B) Изменение дозовой компенсации было рассчитано для каждого гена путем вычитания log 2 (herm / смешанный пол) на более молодой стадии из более старой стадии.Различие между X и аутосомой было проверено с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона (*** = p <10 -3 , * = p <0,05). (C) Чтобы идентифицировать недавно экспрессированные гены в эмбрионах запятой и личинках L1, тепловые карты показывают кластерный анализ K-средних уровней экспрессии у гермафродитов между стадиями. Недавно экспрессированные гены у ранних эмбрионов были идентифицированы, как показано на рис. 2С. У эмбрионов запятой уровни гермафродитов вновь экспрессируемых генов были значительно выше для генов Х-хромосомы по сравнению с аутосомными генами (односторонний критерий суммы рангов Вилкоксона, *** = p <10 -3 , ** = p <10 — 2 и * = p <0.05.). В L1s соотношение экспрессии гермафродитов и смешанного пола существенно не различается между X и аутосомами, что указывает на то, что эти гены в основном компенсируются дозировкой. (D) Коробчатые диаграммы показывают распределение соотношений экспрессии на X и аутосомах между мутантом dpy-27 (y56) и диким типом и (E) между dpy-27 и контрольными РНКи на стадиях развития, перечисленных ниже. Х-хромосома была значительно дерепрессирована по сравнению с аутосомами у мутанта dpy-27 (y56) и dpy-27 РНКи на каждой стадии развития (односторонний критерий суммы рангов Вилкоксона *** = p <10 −3 ) .(F) То же, что и в (D), для мутанта dpy-21 (e428) .
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.g003
В эмбрионах на стадии запятой средняя экспрессия X может быть выше у гермафродитов из-за стабильных транскриптов, сохраненных от ранних эмбрионов. Чтобы проверить это, мы использовали кластерный анализ K-средств и дополнительную фильтрацию, чтобы идентифицировать те гены, которые вновь экспрессируются в эмбрионах на стадии запятой и в личинках L1 (рис. 3C). Вновь экспрессируемые гены Х-хромосомы у личинок L1 доза компенсировались и подавлялись DCC (рис. 3C и S5).У эмбрионов на стадии запятой вновь экспрессируемые гены Х-хромосомы показали значительно более высокую экспрессию гермафродитов по сравнению с аутосомными генами, таким образом, стабильность транскрипта не полностью объясняет значительную смещенную гермафродитами экспрессию Х-хромосом. Возможно, что у эмбрионов запятой экспрессия X выше у гермафродитов, поскольку DCC-опосредованная дозовая компенсация является неполной или больше генов на X-хромосоме имеют экспрессию, обусловленную смещением гермафродитов.
dpy-27 требуется для репрессии Х-хромосомы на протяжении всего развитияСравнение экспрессии генов между полами является мерой дозовой компенсации, но смещенная по полу экспрессия генов затрудняет интерпретацию данных (см. Обсуждение).Чтобы конкретно изучить DCC-опосредованную репрессию X, мы проанализировали изменения экспрессии генов у гермафродитов, мутантных по dpy-27 или после нокдауна dpy-27 РНКи. Поскольку мутанты и черви, обработанные РНКи, показали большую вариабельность по стадиям, мы в основном использовали «эмбрионы смешанной стадии», выделенные путем отбеливания взрослых беременных. Эмбрионы смешанной стадии содержали 100–300 клеток (S4A рис.). Мы использовали dpy-27 РНКи в смешанных эмбрионах и L3 из-за сложности сбора нулевого мутанта dpy-27 (y56) .Анализ вестерн-блоттинга показал ~ 70% и ~ 40% нокдаун DPY-27 у эмбрионов и L3, соответственно (S4B, фиг.). Мутация (Рис. 3D) или истощение (Рис. 3E) dpy-27 вызывали значительную дерепрессию Х-хромосомы у эмбрионов на ранних и смешанных стадиях, у червей L1 и L3. Анализ вновь экспрессируемых генов на каждой стадии также показал, что конденсин DC репрессирует Х-хромосомы на всех этих стадиях развития (S5 фиг.). Следовательно, хотя предыдущие исследования, в которых использовались чувствительные к температуре мутанты различных субъединиц DCC, показали, что критический период времени для активности DCC сосредоточен вокруг стадии эмбриогенеза, запятой, наши результаты предполагают, что DCC действует на протяжении всего развития [12].
Различия в регуляции генов с помощью субъединицы DC конденсина
dpy-27 и неконденсинового члена DCC dpy-21Мы также проанализировали dpy-21 , неконденсиновую субъединицу DCC, нулевая мутация которой ( e428 ) не является летальной, но приводит к дефектам компенсации дозировки Х-хромосомы, включая корявый фенотип [10,11,41] . У смешанных эмбрионов и L3 мутация dpy-21 (e428) также вызывала дерепрессию Х-хромосомы (рис. 3F). У ранних эмбрионов dpy-21 (e428) имел относительно меньший X-специфический эффект по сравнению с dpy-27 (y56) .У dpy-21 (e428) ранних эмбрионов 72% X и 58% аутосомных генов были значительно активированы. У dpy-27 (y56) ранних эмбрионов анализ DESeq не выявил никаких генов, которые соответствовали значимости отсечения (скорректированное значение p <0,05). Но среди первых пяти процентов регулируемых генов dpy-27 , 81% X и 31% аутосомных генов были активированы. Эффект dpy-21 (e428) на экспрессию Х-хромосомы был более специфичным у червей более поздних стадий. Кластеризация и анализ тепловой карты изменений экспрессии генов показал, что dpy-21 (e428) вызывал как повышенную, так и пониженную экспрессию X-хромосом у ранних эмбрионов, тогда как большинство генов X-хромосомы были дерепрессированы у эмбрионов на стадии запятой и L3 (S4C Рис. ).Недавнее исследование отметило, что регуляция ацетилирования h5K16 на Х-хромосомах различается между dpy-21 и другими субъединицами DCC у ранних эмбрионов [29]. Поскольку регуляция экспрессии Х-хромосомы также различалась у мутантов dpy-27 (y56) и dpy-21 (e428) , dpy-21 может иметь DCC-независимую роль у ранних эмбрионов.
DCC непрерывно подавляет транскрипцию в X-хромосоме
Более раннее исследование на микрочипах показало, что примерно половина генов Х-хромосомы компенсируется дозами.Эти гены были идентифицированы по критериям, согласно которым они были активированы у DCC мутантов и одинаково экспрессировались между XX и XO гермафродитными эмбрионами [42]. Впоследствии глобальный анализ (GRO-seq) активной транскрипции в sdc-2 (y93 , RNAi) эмбрионах показал равномерное увеличение уровней Pol II РНК по большинству генов Х-хромосомы [43], предполагая, что существует нет большого отчетливого набора генов, которые избегают DCC-опосредованной репрессии. В соответствии с непрерывным эффектом, наш анализ опубликованных данных GRO-seq показал аналогичную повышающую регуляцию между ранее классифицированными генами с компенсацией дозировки и генами без компенсации (рис. 4A).У эмбрионов со смешанной стадией dpy-27 RNAi mRNA-seq также обнаруживает дерепрессию генов Х-хромосомы. Дерепрессия была немного сильнее для ранее определенных компенсированных генов, предполагая, что посттранскрипционная регуляция вносит вклад в конечные уровни мРНК у мутантов DCC.
Рис. 4. DCC-опосредованная репрессия транскрипции применяется непрерывно через гены Х-хромосомы.
(A) Коробчатые диаграммы показывают распределение соотношений генов GRO-seq-тело 2 в sdc-2 (y93 , РНКи) по сравнению с контрольными эмбрионами смешанной стадии, взятыми из опубликованных данных [43].Гены с компенсацией дозировки (синий) и некомпенсированной (желтый) были ранее классифицированы в экспериментах с микрочипами [42]. В среднем ранее обозначенные компенсированные и некомпенсированные классы демонстрировали сходную повышающую регуляцию транскрипции после обработки sdc-2 (y93 , RNAi) . Такой же анализ был проведен с использованием данных мРНК-seq, сравнивающих dpy-27 с контрольными РНКи в смешанных эмбрионах. В этом случае некомпенсированные классы показали меньшую активацию, измеренную с помощью mRNA-seq. (B) Модель смеси была использована для представления присутствия субпопуляций в общей популяции и применена к отношениям экспрессии GRO-seq всех измеренных генов.Эта модель определила два распределения, аналогичные эмпирическому X и аутосомному распределению. Значения выше смоделированных распределений показывают среднее значение для каждого распределения. (C, D) Тот же подход модели смеси был использован для анализа субпопуляций в пределах только Х-хромосомы с использованием данных GRO-seq (C) и dpy-27 (y56) мРНК-seq (D) в смешанных эмбрионах. Обе субпопуляции показали повышенную регуляцию, таким образом, эффект DCC кажется непрерывным, так что ни один большой отдельный класс генов полностью не ускользает от регуляции DCC.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.g004
Чтобы дополнительно проверить, действует ли DCC на отдельный набор генов на X, мы проанализировали распределение изменений экспрессии, вызванных нарушением DCC. Мы использовали стандартный алгоритм максимизации ожидания, который смешивает несколько нормальных распределений для моделирования общего паттерна изменений выражений. Мы рассудили, что если существует большая группа генов, специфически репрессированных DCC, когда два распределения принудительно зависят от данных, одно распределение должно отражать экспрессию регулируемых DCC генов, а другое должно отражать гены, не регулируемые DCC.Действительно, применительно ко всем данным GRO-seq генома можно смоделировать два распределения. Разделение двух распределений со средними кратными изменениями -0,37 и 0,69 близко отражало распределения изменений для аутосом и Х-хромосомы (рис. 4B). Это указывает на то, что анализ чувствителен к обнаружению дифференциально регулируемых генов с помощью DCC. Затем мы применили тот же метод к X-хромосоме, используя данные GRO-seq (рис. 4C) и данные мРНК-seq из dpy-27 (y56) L1s (рис. 4D).В обоих случаях все разделенные распределения продемонстрировали повышающую регуляцию, что позволяет предположить, что не существует большой группы генов, которые избегают регуляции DCC на X. Это не исключает возможности того, что разные группы генов затронуты на разных уровнях, но этот эффект должен быть непрерывный, а не дискретный.
Мутации в
set-1 и set-4 влияют на компенсацию дозировки Х-хромосомыВ C . elegans , h5K20 монометилируется с помощью SET-1, а h5K20me1 превращается в ди- и три-метилирование с помощью SET-4 [18,19].Одновременное обогащение h5K20me1 и истощение h5K20me3 на X хромосомах указывает на то, что DCC увеличивает уровни h5K20me1 на X за счет снижения активности SET-4 [18] (Fig 5A). X-обогащение h5K20me1 требует субъединиц DCC, включая dpy-21 [18]. Мы проанализировали изменения экспрессии по всему геному, которые происходят у dpy-21 (e428) , set-1 (tm1821) и set-4 (n4600) нулевых мутантов [18,19]. Нулевой мутант Set-1 является стерильным по материнскому эффекту, а нокдаун RNAi set-1 приводит к взрослым особям с дефицитом зародышевой линии, поэтому мы не смогли изолировать эмбрионы.Таким образом, мы собрали set-1 (tm1821), гомозиготных и гетерозиготных личинок L3 (см. Материалы и методы). Вестерн-блоттинг в экстрактах целых личинок показал ожидаемые изменения в h5K20me1 (рис. 5B) [18,19]. h5K20me1 уменьшился в dpy-21 (e428) , увеличился в set-4 (n4600) и был исключен в set-1 (tm1821) . Иммунофлуоресцентный анализ ядер кишечника также показал, что h5K20me1 выше по X у N2 червей дикого типа; снижается до аутосомных уровней у мутанта dpy-21 (e428) ; и увеличивается и становится равным между X и аутосомами у мутанта set-4 (n4600) [19].
Рис. 5. Правильная регуляция метилирования h5K20 важна для компенсации дозировки Х-хромосомы.
(A) Метилирование h5K20 катализируется в две стадии гистоновыми метилтрансферазами SET-1 и SET-4. Предыдущая работа предположила, что DCC вызывает обогащение h5K20me1 на Х-хромосоме за счет снижения катализируемого SET-4 превращения h5K20me1 в h5K20me2 / 3 на X [18]. (B) Вестерн-блот-анализ уровней h5K20me1 в N2 дикого типа, набор-4 (n4600) , dpy-21 (e428) и набор-1 (tm1821) нуль-мутантных личинок L3.(C, D) Распределение log 2 -кратных различий уровней мРНК между мутантными и дикими червями у (C) личинок L3 и (D) смешанных эмбрионов. Все три мутации показали значительную разницу между X и изменениями аутосомной экспрессии (критерий суммы рангов Вилкоксона, *** = p <10 -3 ). (E) Значения дифференциальной экспрессии мРНК L3-seq нанесены на график для ранее обозначенных генов с компенсацией дозировки [11,42,102]. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего. (F) Распределение изменений экспрессии (ось x) у трех мутантов показывает сдвиг в экспрессии Х-хромосомы, таким образом, разница между X и аутосомами на панели C не определяется небольшим количеством генов.(G) Среднее обогащение ChIP-seq РНК-полимеразы II (AMA-1) для каждой хромосомы нанесено на график по сайтам начала транскрипции (TSS) и конечным сайтам транскрипции (TES) для дикого типа, dpy-21 (e428) и набора-4. (n4600) эмбриона смешанной стадии.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.g005
Снижение h5K20me1 из-за нулевой мутации set-1 или dpy-21 привело к значительному увеличению экспрессии Х-хромосомы по сравнению с аутосомами в L3 личинки (рис. 5C).Мы наблюдали небольшое, но значительное увеличение экспрессии X по сравнению с аутосомами в set-4 (n4600) мутант L3 (рис. 5C) и эмбрионах смешанной стадии (рис. 5D). Экспрессия ранее определенных генов с компенсацией дозировки [11,23,42] была увеличена в dpy-21 (e428) , set-1 (tm1821) , но не так сильно в set-4 (n4600) мутанте ( Рис 5E). Чтобы проверить, является ли подмножество генов Х-хромосомы ответственным за эффект, наблюдаемый в мутанте set-4 (n4600) (рис. 5C), мы построили график распределения соотношений экспрессии на X и аутосомах (рис. 5F).Это указывает на небольшой сдвиг между X и аутосомами, предполагая, что set-4 (n4600) оказывает незначительное влияние на все гены, а не большое влияние на подмножество генов X-хромосомы. Обратите внимание, что mRNA-seq измеряет относительные изменения экспрессии, а не абсолютные. Следовательно, дерепрессия X, наблюдаемая у мутанта set-4 (n4600) , может не быть специфической дерепрессией X, как обсуждается ниже в результатах. Тем не менее, эффекты мутаций set-1 и set-4 указывают на то, что правильная регуляция метилирования h5K20 важна для компенсации дозировки Х-хромосомы.
dpy-21 и set-4 регулируют связывание РНК Pol IIGRO-seq анализ sdc-2 (y93 , RNAi) эмбрионов показал, что DCC снижает РНК Pol II на промоторах Х-хромосомы [43]. Чтобы проверить, вызваны ли изменения экспрессии, наблюдаемые в мутантах dpy-21 (e428) и set-4 (n4600) , транскрипция, мы провели анализ ChIP-seq AMA-1 (большая субъединица РНК Pol II). Среднее обогащение РНК Pol II по сайтам начала и конца транскрипции показало накопление 3 ’, которое также было отмечено в анализе GRO-seq для C . elegans гена (рис. 5G) [43]. РНК Pol II на промоторах Х-хромосомы увеличилась по сравнению с аутосомами у мутанта dpy-21 (e428) (рис. 5G). В мутанте set-4 (n4600) (рис. 5G) наблюдался тонкий сдвиг в уровнях РНК Pol II между X и аутосомами, предполагая, что эффект set-4 также находится на уровне транскрипции. Эти результаты не исключают посттранскрипционные эффекты, способствующие увеличению экспрессии X в мутантах dpy-21 (e428) и set-4 (n4600) , но предполагают, что dpy-21 и set-4 действуют на уровне транскрипции.
Дифференциальная экспрессия в
dpy-27 РНКи, dpy-21 , set-1 и set-4 мутант L3sВ отличие от других субъединиц DCC, dpy-21 не является существенным, но требуется для обогащения h5K20me1 на Х-хромосомах [11,18,19]. Чтобы понять роль dpy-21 в DCC, мы сравнили изменения экспрессии генов в dpy-27 RNAi, dpy-21 (e428) , set-1 (tm1821) и set-4 ( n4600) мутантных личинок L3 путем кластеризации дифференциальных соотношений экспрессии на Х-хромосоме и аутосомах (рис. 6А).Отметим, что хотя действие dpy-27 RNAi и dpy-21 (e428) в целом было сходным на X, гены в нескольких кластерах были затронуты по-разному между dpy-27 RNAi и dpy-21 (e428 ) . Мы выполнили анализ онтологии генов (GO), сравнивая расширенные функции в каждом кластере по сравнению со всем геномом (рис. 6B). Интересно, что действие dpy-27, РНКи и dpy-21 (e428) на кластеры, обогащенные генами кутикулы, было противоположным, но обе мутации приводят к фенотипу «корявый».
Рис. 6. Регуляция генов dpy-27 , dpy-21 , set-4 и set-1 по Х-хромосоме и аутосомам.
(A) Кластеризация K-средних была выполнена с использованием log 2 отношений экспрессии в dpy-27 / контрольная РНКи, dpy-21 (e428) / N2, набор-4 (n4600) / N2 , набор-1 (tm1821) гомозиготных / гетерозиготных червей L3. Кластеры обозначены цветом и номером справа от тепловой карты.(B) Анализ терминов GO указывает на обогащение функций генов для каждого кластера по сравнению с остальной частью X или аутосом. Дополнительные условия GO представлены в файле S4.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.g006
h5K20me1 увеличивает весь геном у мутанта
set-4 , выравнивая X и аутосомные уровниПоскольку наша модель DCC-регуляции h5K20me1 утверждает, что DCC снижает активность SET-4, дерепрессия X в мутанте set-4 была несколько неожиданной.Для дальнейшего изучения этого мы выполнили анализ ChIP-seq h5K20me1 у мутантных эмбрионов dpy-21 (e428) и set-4 (n4600) и личинок L3 дикого типа. Экспериментальные повторы хорошо коррелировали друг с другом (S6A фиг.). h5K20me1 обогащен тельцами активных генов у многих видов [44]. В C . elegans гермафродит L3s, h5K20me1 обогащен экспрессируемыми генами, но также и по всей Х-хромосоме, включая молчащие гены и межгенные области (рис. 7А). Такой паттерн обогащения h5K20me1 на X может быть достигнут путем равномерного отложения h5K20me1 с помощью SET-1 во время M фазы с последующим DCC-опосредованным снижением активности SET-4 по X хромосоме [18].Однако стандартный анализ ChIP-seq не может обнаружить равномерного увеличения из-за этапа анализа, который нормализует глубину считывания между экспериментами [45,46]. Поэтому для анализа изменения h5K20me1 в отсутствие SET-4 мы использовали C . briggsae ChIP-экстракт в качестве дополнительного контроля, аналогично предыдущим подходам (рис. 7B) [45,47]. Реплики коррелировали друг с другом (S6B фиг.). Здесь мы предполагаем, что обогащение ChIP-seq вычислено из C . briggsae чтения должны быть одинаковыми для set-4 (n4600) и дикого типа, так как в C добавлены шипы. briggsae экстракт то же самое. Для каждого образца ChIP соответствующий вход также был упорядочен, таким образом, нормализация внутренне контролируется по отношению к любой разности потенциалов в соответствующей пропорции. Мы нормализовали обогащение h5K20me1 ChIP от C . elegans соответствует C . briggsae считывает и рассчитывает соотношение уровней h5K20me1 между set-4 (n4600) и червями дикого типа (рис. 7B).
Рис. 7. Нормализованные анализы h5K20me1 в set-4 (n4600) нуль-мутанте предполагают увеличение всего генома, которое уравнивает X и аутосомные уровни h5K20me1.
(A) h5K20me1 ChIP-seq у червей L3 дикого типа N2. Средние показатели обогащения ChIP-seq были нанесены на график для каждой хромосомы по сайтам начала транскрипции (TSS), по середине межгенных областей, которые находятся на расстоянии> 5 т.п.н. от любого гена, и по TSS верхнего и нижнего квинтилей экспрессируемых генов. (B) Схематическое изображение эксперимента с добавлением ChIP-seq. Экстракт ЧИП получали из С . briggsae смешивали с экстрактами, полученными из C . elegans червей до чипа h5K20me1.Шип C . briggsae Экстракт одинаков для образцов дикого типа и мутантных образцов. Обогащение h5K20me1 ChIP на основе общего количества считываний, которые однозначно отображаются на C . elegans был нормализован обогащением, рассчитанным на основе считываний, которые однозначно соответствуют C . briggsae геном. Для каждого набора данных входная выборка также была упорядочена, что обеспечило внутренний контроль. (C) Пик в скорректированных коэффициентах обогащения h5K20me1 отражает уровень увеличения h5K20me1 у мутантов set-4 (n4600) по сравнению с диким типом для каждой хромосомы у червей L3.(D) Среднее обогащение h5K20me1 ChIP-seq наносили на график по сайтам старта транскрипции у личинок dpy-21 (e428) и set-4 (n4600) L3. Темные линии — это традиционно нормализованные данные. Шкала оси Y была увеличена по сравнению с панелью A, чтобы учесть предполагаемое обогащение (более светлые линии) в наборе-4 (n4600) на основе коэффициентов коррекции всплеска из панели C. (E) Типичный браузер генома UCSC виды оценок ChIP-seq для h5K20me1 (левая панель) и DPY-27 (правая панель).Для набора set-4 (n4600) предполагаемое обогащение, основанное на смещенных значениях всплеска, было нанесено серым цветом за традиционно нормализованными отношениями ChIP-seq.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.g007
В set-4 (n4600) L3s было ~ 10-кратное увеличение h5K20me1 на аутосомах и ~ 6-кратное увеличение на X-хромосоме (Рис. 7C). Это согласуется с идеей, что у червей дикого типа DCC уже снижает активность SET-4 на X наполовину, таким образом, в отсутствие SET-4 увеличение h5K20me1 на аутосомах примерно в два раза больше по сравнению с увеличением на X.Исследования иммунофлуоресценции на нуль-мутантах set-4 также показали общее увеличение h5K20me1, приводящее к выравниванию уровней X и аутосомного h5K20me1 [18,19]. Построение графика обогащения h5K20me1, измеренного с помощью стандартного анализа ChIP-seq по стартовым сайтам транскрипции, иллюстрирует выравнивание уровней h5K20me1 между X и аутосомами у мутантов dpy-21 (e428) и set-4 (n4600) (рис. 7D и S7A). . На этих графиках эксперименты с ChIP-seq были выполнены без дополнительного контроля, и увеличение всего генома h5K20me1 в мутанте set-4 (n4600) было замаскировано.Корректировка значений обогащения с помощью коэффициентов пиков, полученных из фиг. 7C, иллюстрирует предполагаемые уровни h5K20me1 в мутантных L3 set-4 (n4600) (более светлые цвета на фиг. 7D). Десятикратное увеличение уровней h5K20me1 в геноме было неожиданным, основываясь на наблюдении, что вестерн-блот-анализ h5K20me1 показал приблизительно пятикратное увеличение в set-4 нулевых мутантных L3 (фиг. 4B). Основа этой разницы между двумя разными анализами (ChIP против вестерн-блоттинга) неясна.Десятикратное увеличение h5K20me1 может быть возможным в свете предыдущих исследований на клетках млекопитающих, которые показали, что ~ 80% h5 диметилировано по h5K20 [48,49]. Если деметилирование h5K20me1 неэффективно в C . elegans , set-4 мутация может приводить к высоким уровням монометилирования.
Задержка обогащения h5K20me1 и компенсации дозировки
Величина увеличения h5K20me1 и разница между X и аутосомами была больше в L3 по сравнению с эмбрионами смешанной стадии у мутанта set-4 (n4600) (S7B фиг.).Это может быть связано с меньшим обогащением h5K20me1 X у эмбрионов по сравнению с L3s, что согласуется с обогащением h5K20me1, происходящим позже в эмбриональном развитии [18,29]. Неполное X-обогащение h5K20me1 в эмбрионах смешанной стадии также отражалось меньшим обогащением h5K20me1 ChIP-seq на X-хромосоме у эмбрионов дикого типа по сравнению с L3 (Рис. 7E, левая панель).
Отсроченное обогащение h5K20me1 может также вызвать задержку полной компенсации дозировки. Экспрессия Х-хромосомы не была полностью сбалансирована между полами во время эмбриогенеза (рис. 3А).Хотя это может быть связано с различиями в экспрессии смещенной по полу между стадиями развития (см. Обсуждение), это также может быть связано с немного меньшей дозовой компенсацией из-за неполного обогащения h5K20me1 на Х-хромосомах до стадии эмбриогенеза через запятую. Действительно, дерепрессия Х-хромосомы при истощении dpy-27 была немного, но значительно выше у личинок L3 по сравнению с эмбрионами смешанной стадии (рис. 3E, значение p критерия суммы рангов Вилкоксона = 5×10 -7 ). Это было несмотря на более эффективный нокдаун DPY-27 у эмбрионов по сравнению с личинками L3 (S4B Рис).X-обогащение h5K20me1 может немного усиливать DCC-опосредованную репрессию Х-хромосомы в более позднем развитии.
У мутанта
set-4 репрессия аутосом приводит к относительному эффекту дерепрессии XНебольшая, но значительная дерепрессия X, наблюдаемая у мутанта set-4 (n4600) , указывает на то, что баланс X / A h5K20me1 вносит незначительный вклад в компенсацию дозировки X хромосомы (Рис. 4C). Чтобы выяснить механизм этого вклада, мы дополнительно проанализировали экспрессию гена в мутанте set-4 (n4600) .Так как mRNA-seq измеряет относительные изменения экспрессии, мы не смогли различить, является ли относительная дерепрессия X, наблюдаемая у мутанта set-4 (n4600) , репрессией аутосом или увеличением X. Поэтому мы адаптировали spike- в схеме нормализации для анализа мРНК-seq (рис. 8A). Для этого мы смешали 1000 C . briggsae червей до 10 000 N2 (дикий тип) или set-4 мутантных червей перед экстракцией РНК и анализом мРНК-seq. Мы использовали скармливаемых червей L1, где можно было достоверно предположить, что количество клеток было одинаковым у дикого типа и мутанта.Реплики хорошо коррелировали друг с другом (S8A фиг.). С добавлением C . briggsae червей были одинаковыми во всех выборках, мы нормализовали C . elegans уровней экспрессии с использованием коэффициентов линейной регрессии, которые уравняли C . briggsae между образцами дикого типа и мутантными образцами (S8B фиг.).
Рис. 8. Нормализованные анализы экспрессии генов в нуль-мутанте set-4 (n4600) предполагают, что аутосомная репрессия приводит к чистому эффекту дерепрессии X.
(A) Схематическое изображение эксперимента с добавлением мРНК-seq. Здесь мы посчитали и смешали в C . briggsae L1s с C . elegans L1 до выделения общей мРНК. Так как шипованный C . briggsae черви одинаковы и смешаны в той же пропорции, мы нормализовали экспрессию из C . elegans к C . briggsae . Нормализация была произведена путем определения коэффициентов линейной регрессии, которая уравняла C . briggsae соотношение экспрессии между мутантом и диким типом, и применение этих параметров к C . elegans соотношений экспрессии (S8B фиг.). (B) Коробчатая диаграмма показывает распределение скорректированных log 2 кратных изменений уровня мРНК между набором-4 (n4600) и личинками L1 дикого типа. (C) Сравнение значений дифференциальной экспрессии, определенных с помощью spike-in mRNA-seq и RT-qPCR для ряда генов на X и аутосомах. Поскольку RT-qPCR также основывается на предположении, что общая РНК не изменяется между диким типом и мутантом, мы использовали амплификацию двух C . briggsae , чтобы исправить разницу в экспрессии между диким типом и мутантом (см. Материалы и методы). Более темные столбцы показывают значения относительной экспрессии RT-qPCR (мутантный / дикий тип), а более светлые столбцы показывают всплеск скорректированных значений. Кружками показаны соответствующие соотношения дифференциальной экспрессии мРНК-seq с (красный) и без (розовый) всплеска коррекции. Планки погрешностей представляют собой относительную стандартную ошибку среднего из трех биологических повторов. (D) Интерпретация данных spike-in mRNA-seq и RT-qPCR предполагает, что более сильная репрессия со стороны аутосом в мутанте set-4 (n4600) приводит к относительному увеличению по сравнению с X.(E) Текущая модель временной динамики и роли DCC и h5K20me1 в репрессии Х-хромосомы. Сплошные стрелки и их толщина указывают уровень репрессии. Пунктирная стрелка представляет возможную роль h5K20me1 в усилении опосредованной DCC репрессии. На временной шкале развития показаны эмбрионы на ранних стадиях до и после активации DCC, эмбрионы на стадии запятой и личинки. Овалы представляют собой ядра с сигналами DCC (вверху) и h5K20me1 (внизу) розовым и желтым цветом. Для простоты локализация Х-хромосомы представлена более темными цветами в одном субядерном домене.В раннем эмбриогенезе, когда DCC начинает загружаться в Х-хромосомы, он начинает репрессию. Связывание DCC приводит к увеличению h5K20me1 на Х-хромосоме, что вносит небольшой вклад в репрессию в более позднем развитии.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.g008
Спайк-анализ уровней мРНК-seq в мутанте set-4 (n4600) показал снижение экспрессии в аутосомах (рис. 8B), в результате в относительном эффекте дерепрессии X, показанном на фиг. 4C.Чтобы проверить метод spike-in mRNA-seq, мы сравнили его с анализом RT-qPCR для ряда генов. RT-qPCR выполняли на тех же препаратах тотальной РНК, которые использовали для создания библиотек mRNA-seq. Поскольку RT-qPCR также основывается на предположении, что общие уровни мРНК одинаковы для дикого типа и мутанта, два C . гена briggsae использовали в качестве стандарта. Результаты стандартного и пикового нормализованных результатов RT-qPCR были аналогичны результатам анализа мРНК-seq (рис. 8C).
Модель роли h5K20me1 в дозовой компенсации Х-хромосомы
Мы считаем, что если h5K20me1 действует как нижестоящий эффектор DCC (т. Е. Эффект h5K20me1 на репрессию транскрипции был одинаковым для X и аутосом), выравнивание h5K20me1 между X и аутосомами должно приводить к одинаковому уровню X-хромосомы. дерепрессия. Два наблюдения показали, что хотя h5K20me1 важен, баланс X / A h5K20me1 не отвечает за репрессию Х-хромосомы.Во-первых, при выравнивании уровней h5K20me1 между X и аутосомами в мутанте set-4 (n4600) , Х-хромосома лишь слегка дерепрессируется (рис. 5C). Во-вторых, истощение h5K20me1 в мутанте set-1 (tm1821) привело к большей дерепрессии X по сравнению с выравниванием h5K20me1 между X и аутосомами в мутанте set-4 (n4600) (рис. 5C). Таким образом, h5K20me1 не действует как единственный нижестоящий эффектор DCC. Основываясь на пике в контролируемых анализах ChIP-seq и mRNA-seq в мутанте set-4 (n4600) , мы предлагаем модель, согласно которой обогащение h5K20me1 лишь незначительно репрессирует транскрипцию X-хромосомы, но h5K20me1 может положительно влиять на активность DCC, что является в первую очередь ответственны за репрессию X (рис. 8E).
Обсуждение
Разница в дозировке толерантной Х-хромосомы во время эмбриогенеза
Наши результаты показывают, что в раннем эмбриогенезе Х-хромосома не полностью компенсируется дозой в C . elegans . Тогда как переносится разница в дозировке Х-хромосомы? Во-первых, материнская загрузка мРНК в ооциты помогает уравнять общие уровни транскриптов Х-хромосомы между двумя полами, таким образом, гены, важные для развития обоих полов, могут быть обеспечены в ооците.Во-вторых, Х-хромосома содержит меньше генов, выполняющих важные функции для эмбриогенеза [50]. В-третьих, гены, чувствительные к дозировке, такие как гаплонедостаточные гены, истощаются из Х-хромосомы [51,52]. Мы также обнаружили, что C . elegans X-хромосома имеет меньше генов, которые кодируют мульти-субъединичные белковые комплексы, которые, как было обнаружено, более чувствительны к дозировке [53–55]. Существует только 16 генов Х-хромосомы с дрожжевым гомологом мультибелкового комплекса [52], что свидетельствует о значительном истощении таких генов из X (p <10 -5 , точный тест Фишера).Для остальных генов, чувствительных к дозе на X, помимо опосредованной DCC репрессии, могут действовать потенциальные посттранскрипционные механизмы, поскольку такая регуляция обширна в C . elegans [56]. Таким образом, комбинация различных механизмов буферизует разницу в дозировке Х-хромосомы между гермафродитом и самцами во время раннего эмбриогенеза.
Компенсация дозы и экспрессия генов с учетом пола
Сравнение уровней экспрессии генов между гермафродитными и мужскими эмбрионами отражает два генетических различия: число Х-хромосомы и экспрессию генов, зависимую от пола.Другие и мы показали, что Х-хромосома содержит большее количество генов, связанных с гермафродитами [51,57]. Это может способствовать более высокой экспрессии X у гермафродитов по сравнению с эмбрионами смешанного пола (Рис. 3). Однако наибольший половой диморфизм у C . elegans развивается на личиночных стадиях (рассмотрено в [58]), а гонады взрослых вносят особенно высокий уровень экспрессии генов, зависимых от пола [51]. В самом деле, mRNA-seq реплицируется у гермафродитов и червей смешанного пола, сгруппированных по стадиям развития, а не по полу, до стадии молодого взрослого человека (S1A фиг.).Таким образом, у эмбрионов и личинок экспрессия генов развития имеет более сильное влияние на транскриптом, чем экспрессия генов, обусловленная полом. Тем не менее, у эмбрионов наблюдается смещенная по полу экспрессия генов, включая гены, участвующие в пути определения пола (рис. 2D). Интересно, что XSEs были компенсированы дозировкой во время позднего эмбриогенеза, это указывает на то, что DCC действует на эти гены независимо от их ранней гермафродитно-смещенной экспрессии [36] (S3 Fig). Возможно, что DCC-опосредованная репрессия генов распространяется на всю хромосому и накладывается на другие механизмы регуляции, которые действуют на уровне отдельных генов, такие как программы экспрессии генов с предвзятым отношением к полу.Необходимы дальнейшие исследования, которые отделяют пол от числа Х-хромосомы, чтобы разрешить связь между дозовой компенсацией и экспрессией генов, обусловленной полом.
Функция DCC-опосредованной репрессии Х-хромосомы
Хотя дозовая компенсация Х хромосомы важна для правильного развития, все еще не ясно, как мутации DCC вызывают летальность (rev. [1]). Для многих животных важна правильная дозировка хромосом, поскольку трисомия или моносомия хромосом не переносятся (см. Обзор [59]).Проблемы компенсации дозировки Х-хромосомы у млекопитающих и червей могут вызвать активацию генов Х-хромосомы. В случае трисомии повышенная экспрессия набора генов, чувствительных к дозировке, может вызвать проблемы, как при синдроме Дауна (см. Обзор [60]). Кроме того, повышенная экспрессия всей хромосомы оказывает давление на протеасомные пути, необходимые для деградации дополнительных белков, как было показано на дрожжах [61]. Мутации DCC вызывают дерепрессию многих генов Х-хромосомы, которые участвуют в широком диапазоне процессов (рис. 6).Гены, которые активируются в мутанте dpy-27 , включают несколько факторов транскрипции и киназ, избыточная экспрессия которых может вызывать нецелевые эффекты (обсуждается в [62]). Хотя возможно, что комбинация ряда чувствительных к дозе генов на X ответственна за фенотипы DCC, DCC-опосредованная репрессия применяется к X-хромосоме (рис.4), предполагая, что DCC эволюционировал, чтобы репрессировать средний ген X-хромосомы. дозировка.
Динамика развития обогащения h5K20me1 на Х-хромосомах
DCC начинает связываться с X-хромосомами примерно на стадии 40 клеток, за которым следует обогащение h5K20me1 на X, которое происходит между стадиями 100 клеток и запятой [18,29].Поскольку DCC снижает активность SET-4, а SET-4 требует предварительного монометилирования h5K20 для катализа ди- и триметилирования, обогащение h5K20me1 на X может происходить только после начального отложения h5K20me1 во время деления клетки. Задержка в обогащении h5K20me1 во время эмбриогенеза может быть связана с необходимостью деления клеток для первоначального депонирования h5K20me1. В клетках культуры ткани млекопитающих регуляция клеточного цикла SET-1 обеспечивает резкое увеличение h5K20me1 на митотических хромосомах [63,64].h5K20me1 также увеличивается на митотических хромосомах в C . elegans [18,29]. Следовательно, возможно, что для последовательного увеличения h5K20me1 на C необходимо несколько делений. elegans X-хромосом. Основанное на микроскопии исследование обогащения h5K20me1 через несколько делений в одном клеточном клоне может рассмотреть эту возможность.
Косвенная роль
set-4 в компенсации дозировки Х-хромосомыРанее мы предположили, что DCC увеличивает h5K20me1 за счет снижения активности SET-4 на Х-хромосомах [18].Анализ экспрессии гена в нуль-мутанте set-4 предположил влияние на компенсацию дозировки Х-хромосомы (рис. 5C). Этот эффект был косвенным, так как в среднем ~ 20% сокращение по аутосомам привело к относительной дерепрессии Х-хромосомы по сравнению с аутосомами (рис. 8B). Поскольку увеличение h5K20me1 в нуль-мутанте set-4 приводит к репрессии, обогащение h5K20me1 на Х-хромосоме может незначительно способствовать репрессии у гермафродитов. Метилирование h5K20 играет роль в экспрессии генов и у других организмов, но механизмы остаются неясными [65].
Возможно, что h5K20me1 положительно регулирует уплотнение хроматина, тем самым снижая доступность РНК-полимеразы II для Х-хромосом. h5K20me1 обогащен митотическими хромосомами и неактивной Х-хромосомой у млекопитающих [65]. В C . elegans , h5K20me1 обогащен на митотических хромосомах и по всей X (Рис. 7A), что более компактно у гермафродитов [66]. И set-1 , и set-4 приводили к относительному увеличению объема Х-хромосомы по сравнению с аутосомами у гермафродитов [66].В то время как set-4 важен для X-уплотнения, нулевой мутант показал лишь небольшое влияние на дозовую компенсацию X-хромосомы и не имел явных фенотипов дозовой компенсации в стандартных лабораторных условиях (фиг. 5C). Следовательно, уплотнение X само по себе не полностью объясняет DCC-опосредованную репрессию X хромосомы.
Регуляция метилирования h5K20 с помощью set-4 может участвовать в дополнительных процессах. Set-4 Нокдаун увеличивал продолжительность жизни при скрининге RNAi [67] и подавлял задержку развития, связанную с мутантом rict-1 , компонентом мишени рапамицинового комплекса 2 [68].Изменения экспрессии генов, которые происходят у мутанта set-4 , могут быть основой этих фенотипов. Альтернативно, set-4 может действовать через другие негистоновые субстраты, как недавние эксперименты в D . melanogaster показал, что мутация h5K20A не полностью воспроизводит фенотип мутанта метилтрансферазы [69].
Роль h5K20me1 в дозовой компенсации Х-хромосомы
Наша рабочая модель для компенсации дозировки h5K20me1 в Х-хромосоме представлена на рис. 8E.Вкратце, X-обогащение h5K20me1 вносит небольшой вклад в репрессию Х-хромосомы, но h5K20me1 сам по себе не является основным нижестоящим эффектором DCC. Напротив, уровень h5K20me1 важен для DCC-опосредованной репрессии Х-хромосом. Одна возможность состоит в том, что h5K20me1 может увеличивать ассоциацию конденсина DC с хроматином. В соответствии с этой возможностью, было немного меньше связывания DPY-27 у мутантных эмбрионов dpy-21 (e428) , у которых h5K20me1 больше не обогащен на Х-хромосоме (S7C фиг.).В клетках млекопитающих домены HEAT, обнаруженные в субъединицах N-CAPD3 и N-CAPG2 конденсина II, связываются с h5K20me1, содержащим пептиды гистоновых хвостов, и предполагалось, что это взаимодействие увеличивает связывание конденсина II на митотических хромосомах, которые обогащены h5K20me1 [70]. DCC содержит две субъединицы с доменами HEAT, DPY-28 и CAPG-1 [20]. Положительная регуляция DCC с помощью h5K20me1 может помочь поддерживать комплекс дозовой компенсации на X на более поздних стадиях развития в C . elegans .Такие поддерживающие механизмы участвуют в регуляции эпигенетических генов и, как было продемонстрировано, важны для инактивации X млекопитающих [71,72].
Механизм репрессии транскрипции DCC
Предыдущая работа и наши результаты предполагают, что DCC репрессирует транскрипцию Х-хромосомы. Молекулярный механизм, с помощью которого DCC подавляет транскрипцию, остается неясным. У различных организмов конденсины демонстрируют такие активности, как положительная суперспирализация [73–75], повторный отжиг одноцепочечной ДНК [76,77] и создание топологических связей в ДНК [78,79].Неизвестно, обладает ли конденсин DC такой активностью.
DCC обогащен активными промоторами [80], а DCC снижает связывание РНК Pol II с промоторами Х-хромосомы [43]. Оценка связывания DCC ChIP на промоторах положительно коррелирует с количеством транскрипции [81]. Положительная корреляция между связыванием конденсина и транскрипцией наблюдалась также в клетках дрожжей и млекопитающих [77,82–84]. Мы предположили, что связывание уровня связывания DCC с уровнем транскрипции на каждом промоторе может быть основой двукратного снижения экспрессии генов независимо от уровня экспрессии [80].Действительно, анализ GRO-seq показал, что хотя связывание DCC положительно коррелирует с транскрипцией, уровень DCC-опосредованного снижения РНК Pol II сходен для генов, транскрибируемых на широком диапазоне уровней [43]. Основываясь на наблюдении, что DCC связывается с промоторами и что дрожжевой конденсин взаимодействует с TBP [83], возможно, что DCC рекрутируется на промоторы с помощью общего фактора транскрипции, а затем вдвое снижает скорость связывания РНК Pol II на каждом этапе. цикл транскрипции.
Были предложены альтернативные, но не исключительные механизмы DCC, такие как уплотнение хроматина для уменьшения доступа активаторов к Х-хромосоме или изменение взаимодействий между энхансером и промоторами для уменьшения рекрутирования РНК Pol II [43].Эти модели основаны на наблюдениях, что конденсины необходимы для конденсации хромосом и у других организмов, таких как D . melanogaster и клетки млекопитающих, конденсины регулируют дальнодействующие хромосомные взаимодействия [85,86]. Недавно было показано, что DCC уплотняет X-хромосому [27], регулирует субъядерную локализацию X [87] и формирует топологически связанные домены на X [88]. Однако остается неясным, являются ли эти крупномасштабные изменения хроматина причиной или следствием повышенной транскрипции с Х-хромосом у мутантов DCC.
В мыши, C . elegans и D . melanogaster , комплексы компенсации доз нацелены на и регулируют структуру хроматина и транскрипцию от X хромосом у одного из двух полов (rev. [1]). Состав комплексов дозовой компенсации предполагает, что разные комплексы координируют различные наборы механизмов регуляции генов в Х-хромосомах. В случае C . elegans , дупликация и дивергенция субъединицы конденсина ( dpy-27 ) создают специфический для компенсации дозы конденсиновый комплекс (конденсин DC), который снижает транскрипцию с обеих Х-хромосом у гермафродитов.Конденсины необходимы для конденсации хромосом во время деления клеток и регулируют уплотнение хроматина и транскрипцию во время интерфазы. h5K20me1 представляет собой обогащенную митозом хроматиновую метку, которая также обогащена Х-хромосомами с компенсированной дозировкой в C . elegans . Наша работа над DCC и h5K20me1 способствует пониманию связи между митотической и интерфазной функцией конденсинов в конденсации хромосом и регуляции генов.
Материалы и методы
Штаммы червей
N2, дикий тип; BS553, туман-2 (oz40) ; CB428, dpy-21 (e428) V ; MK4 dpy-27 (y56) / qC1 [dpy-19 (e1259) glp-1 (q339)] [qIs26] III; SS1075 набор-1 (tm1821) / hT2g [bli-4 (e937) let-? (q782) qIs48] (I; III) ; МТ14911 комплект-4 (н4600) II ; VC199, AF16 C . briggsae дикий изолят.
Рост и сборы червей
Если не указано иное, штаммы поддерживали при 20 ° C на чашках с агаром NGM, используя стандарт C . elegans методов выращивания. Для поэтапного сбора эмбрионов черви были синхронизированы путем отбеливания беременных червей, позволяя эмбрионам вылупиться в течение ночи и выращивая синхронизированные L1 на пластинах NGM в течение ~ 60 часов, пока первые эмбрионы не были замечены в гонадах гермафродитов. Ранние эмбрионы были изолированы от обесцвеченных молодых взрослых особей и немедленно собраны.Эмбрионы запятой были получены путем старения ранних эмбрионов в течение 4 часов в буфере М9. Личинок собирали после выращивания вылупившихся L1 в течение 6 часов (личинки L1) или 24 часов (личинки L3) на чашках NGM. Молодые взрослые особи были синхронизированы путем выращивания вылупившихся L1 в течение 44 часов при 25 ° C и собирались до накопления оплодотворенных эмбрионов в гонаде. Эмбрионы смешанной стадии собирали путем отбеливания взрослых беременных. Стадии развития оценивали путем подсчета ядер, окрашенных DAPI, путем окрашивания DAPI, оценки морфологии зародышевой линии, мужского хвоста и вульвы.
Из-за летальности мутанты set-1 (tm1821) оставались гетерозиготными по балансирующей хромосоме, которая включает маркер GFP (штамм SS1075 [18]). набор-1 / балансировочных гетерозиготных личинок были отобраны путем отбора животных GFP (+), и набор-1 гомозиготных мутантных личинок были идентифицированы путем отбора животных GFP (-). Поскольку dpy-27 (y56) является летальным [12,28], dpy-27 (y56) червей содержались как гетерозиготы с балансирующей хромосомой, которая кодирует rol-6 (su1006) . dpy-27 (y56) гомозиготных эмбрионов были собраны путем отбеливания молодых взрослых людей без фенотипа роллера. Это привело к появлению эмбрионов, у которых отсутствовали как материнские, так и зиготические dpy-27 .
Для DPY-27 RNAi бактериальный штамм из библиотеки Ahringer RNAi, содержащий плазмиду dpy-27 RNAi и контрольную плазмиду, выращивали и индуцировали в 100 мл среды LB в течение 3 часов с 0,1 мМ ITPG, концентрировали в 10 раз и высевали на пластина 10 см NGM с добавлением ампициллина, тетрациклина и 1 мМ IPTG.Синхронизированные L1 помещали на чашки с посевом и собирали через 24 часа (личинки L3) или выращивали до беременных взрослых особей, а эмбрионы собирали путем отбеливания (эмбрионы на смешанной стадии). Во время сбора все образцы промывали 3 раза в буфере M9 и хранили в десяти объемах Trizol (Invitrogen) при -80 ° C. Для получения одной биологической повторности объединяли 2–3 коллекции.
мРНК-seq и ChIP-seq
Сводка по всем наборам данных и репликам представлена в файле S1. Файлы необработанных данных и колебательные дорожки обогащения ChIP на пару оснований, а также значения RNA-seq FPKM представлены в базе данных Gene Expression Omnibus (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под регистрационным номером [GSE67650].
Для приготовления РНК образцы в Trizol замораживали и оттаивали 3–5 раз, чтобы заморозить червей, а фазу, содержащую полную РНК, очищали с помощью набора Qiagen RNeasy. мРНК очищали с использованием гранул Sera-Mag oligo (dT) (ThermoScientific) из 0,5–10 мкг общей РНК. Библиотеки цепочечных мРНК-seq были приготовлены на основе включения dUTP во время синтеза кДНК с использованием ранее описанного протокола [89]. Одностороннее секвенирование 50 п.н. выполняли с использованием Illumina HiSeq-2000.Чтения были сопоставлены с C . elegans версия генома WS220 с Tophat v1.4.1 [90] с использованием параметров по умолчанию. Экспрессия генов была количественно оценена с использованием Cufflinks версии 2.0.2 [91] для чтения, специфичного для цепи, с использованием параметров по умолчанию и предоставлением аннотаций генов. Используемые значения экспрессии генов представляли собой среднее значение по крайней мере трех биологических повторов и представлены в файле S2. Анализ дифференциального выражения был выполнен с использованием DESeq2 версии 1.0.17 [92] в R версии 3.0.2, а значения приведены в файле S3.Все анализы проводились с генами, средний уровень экспрессии которых превышал 1 FPKM (количество фрагментов на килобазу на миллион, как рассчитано с помощью Cufflinks). Кластеризация данных RNA-seq была выполнена кластеризацией K-средних с использованием метода Хартигана-Вонга в R версии 3.02. Анализ GO-термов проводился с использованием GOrilla [93]. Результаты кластерного анализа и анализа GO представлены в файле S4.
ChIP-seqвыполняли, как описано ранее [26], с использованием антитела h5K20me1 (Abcam ab9051), пользовательского антитела DPY-27 [80] и антитела AMA-1 против большой субъединицы РНК-Pol II (modENCODE SDQ2357).Односторонние чтения были согласованы с C . elegans версия генома WS220 с использованием Bowtie 1.0.1 [94], допуская до двух несовпадений в семени, возвращая только лучшее выравнивание и ограничивая чтение для отображения не более чем четырех мест в геноме. Вызов пиков и оценка охвата всего генома были получены с помощью MACS версии 1.4.2 [95] с использованием отображенных считываний из ChIP и ввода. Чтобы оценить окончательный охват генома, охват на основание был нормализован к медианному охвату всего генома, за исключением митохондриальной хромосомы, и входные данные вычитались из ChIP.Реплики были объединены путем усреднения покрытия в каждой базовой позиции по репликам. Для пикового вызова считывания ChIP и ввода были объединены из всех реплик с помощью samtools merge версии 0.1.19 [96], а MACS использовался для пикового вызова. Вызов пиков также производился для каждой реплики, и пики из объединенных данных, которые также встречаются в большинстве реплик, были сохранены. Для сравнений дикого типа и мутантов наборы данных стандартизировали с помощью преобразования z-показателя значений обогащения ChIP на основе предполагаемого фона, исключая области, покрывающие пики MACS (отсечение е-5).
Анализ сходства экспрессии и распределения экспрессии
Статистическая основа для идентификации дифференциально экспрессируемых генов учитывает среднее значение и стандартное отклонение между повторами. Гены, которые не обнаруживаются как дифференциально экспрессируемые, не могут быть обозначены как «статистически» аналогично экспрессируемые, потому что вариабельность между повторами может привести к тому, что эти гены не пройдут статистический тест. Таким образом, чтобы определить гены, которые одинаково экспрессируются у гермафродитов и эмбрионов смешанного пола, мы построили 95% доверительный интервал вокруг коэффициента экспрессии log 2 для каждого гена.Для гена, который будет называться выраженным подобным образом, этот доверительный интервал не может превышать 30% изменение экспрессии. Распределение результатов, выраженных одинаково, равнозначно и по-разному, представлено в файле S5.
Чтобы определить, есть ли два класса DCC-регулируемых генов на Х-хромосоме, мы использовали алгоритм максимизации ожидания для определения распределения изменений экспрессии при нокдауне dpy-27 . Было принято распределение смеси с двумя или тремя компонентами и использовалось лучшее соответствие.Параметры распределения смеси оценивались с помощью пакета mixtools [97] в R версии 3.0.2.
Пик в анализе
Для RNA-seq вылупившиеся L1 скармливали планшетам с засеянным OP50 в течение 6 часов, собирали, подсчитывали три раза и разбавляли до желаемого количества червей на основе среднего количества. 10 000 С . elegans L1 были смешаны с 1000 C . briggsae L1s. RNA-seq выполняли, как описано выше. Считывания мРНК-seq были сопоставлены с C . elegans версия генома WS220 и C . briggsae версия генома WS224 с использованием TopHat (Trapnell et al 2010) версии 2.0.11 и картирование считываний на оба генома были исключены из дальнейшего анализа. Исходное количество для каждого гена оценивалось с помощью htseq-count версии 0.6.1 [98]. Все подсчеты чтения были нормализованы на основе общего количества считываний, и была определена медиана для трех повторов. Линейная модель была адаптирована к высокоэкспрессируемым генам дикого типа и мутанта C . briggsae всплывающих данных, коэффициенты которых использовались для корректировки C . elegans экспрессионных данных.
Для ChIP-seq 0,1–0,2 мг ChIP-экстракта, полученного из C . briggsae эмбриона добавляли к 1-2 мг C . elegans ЧИП-экстракт. Чип и соответствующие входные чтения были сопоставлены с C . elegans версия генома WS220 и C . briggsae версия генома WS224 с использованием Bowtie версии 1.0.1 [94], и картирование считываний на оба генома было отброшено. Чтобы определить коэффициент нормализации всплеска, сопоставленные чтения сначала нормализовались к общему количеству считываний, а затем было вычислено соотношение между ChIP и вводом для однозначно сопоставленных считываний в C . elegans или C . briggsae . Соотношение C . elegans и C . briggsae ChIP / Вход между мутантом и диким типом был использован для корректировки покрытия генома у мутанта.
Анализ RT-qPCR
Мы использовали общую РНК, выделенную для пика в библиотеках. 20 нанограмм общей РНК использовали на 20 мкл одностадийной реакции RT-qPCR (KAPA Biosystems). Для устранения перекрестного усиления между C . elegans и C . briggsae спайк в РНК, были разработаны праймеры для амплификации C . elegans , которые не усиливаются в C . briggsae геном. С . briggsae гена CBG27711 и CBG25839 были выбраны в качестве пика в гене нормализации на основе экспрессии L1, отсутствие C . elegans гомолог и отсутствие амплификации от C . elegans матричная кДНК. Реакции матричной РНК без RT и противоположных видов использовали в качестве контроля для подтверждения специфичности праймеров. Относительное кратное изменение между set-4 (n4600) и диким типом было рассчитано с использованием метода ΔC t , а пик нормализованных изменений был рассчитан с использованием метода ΔΔC t с использованием среднего значения ΔC t для C . briggsae гены CBG27711 и CBG25839 между диким типом и set-4 в качестве второго параметра нормализации [99]. Последовательности праймеров следующие: kin-3, , прямой TTTCAAGGGACCCGAGCTTC, kin-3, , обратный GTGTCGCCCGAGAATATCGT, pmp-2, , прямой CCTGGAGTGGTTGGAATGCTTT, , pmp-2, 913GCC13, обратный TTC1, , pmp-2, 913GCC13, , pmp-2, 913GCC13, обратный T, , pmp-2, 913GCC13, , pmp-2, 913GCCAG, 13 обратный GGTGCCATTCGTGCATTTGT, тег-115 вперед GTTCAGGACCCCGGTCAAAA, тег-115 обратного TTGGAAGTGATCGCTGACCG, вышка-3 вперед GCACCAGGAAACAAGCAAGG, вышка-3 обратного TTGCATCACGGACGTGGTTA, IFP-1 вперед TCCAGAGCGACAGTAGTGGA, IFP-1 обратных TAGTAGTTCGTGCCGGCTTC, RGS-6 вперед AATGTGAGCGAACCCAGCAA, RGS-6 обратный CGCCTCGTCGCCTATTTTTG, DHS-25 вперед CTGGGAGGACGAATTGCTGT, DHS-25 обратный CCCCTTCACACTGTCTGCAT, CBG27711 вперед ATGAGCATAATTCAGAGAGAAAATTTT, CBG27711 обратный CTAGGCATCTATAATTAGGTT, тег-261 вперед CGTAGATGCACGTCTT CAAGC, tag-261 обратный TCTCCGCCTCTTTGAGACCTC, C12D5 . 09 вперед TGACTTTTTCTCGACGGATTTG, C12D5 . 09 обратный CACACCTTCTTTCGTTGGCG, C06C3 . 12 f или более поздняя версия TCGGTGACCGATTCTAATGAA, C06C3 . 12 обратный TTAGCCCACTTCGACTGAGG, B0507 . 10 вперед TCTCAGGAATTGCTAATTCGGC, B0507 . 10 обратный GGCTCTGTGGCGGTTGATAA, tatn-1 вперед BGCTTCTTGAGCAAGCCAAA, tatn-1 обратный CTGCGATCTCACTTGGTGGA, nspc-19 вперед CATTTTGCTGCTCTC13 вперед CATTTTGCTGCTCTCTGCT, 913AC13ACGCT, 913AC13ACGCT, 913AC13ACGC64 1 вперед ATCCGCAACCAACTCTCCTG, B0294 .1 обратный CAAGGTTTTCTCCATTCTTTGGCA, CBG25839 вперед CGCGTCTAAACCAGCCAAAC, CBG25839 913CGAGCTGAACGACGG25839 назад
Вспомогательная информация
S1 Рис. Корреляция наборов данных mRNA-seq.
(A) Коэффициенты парной ранговой корреляции Спирмена между каждым набором данных РНК-seq были рассчитаны путем подсчета считывания генов и были иерархически сгруппированы для репликаций мРНК-seq гермафродита и смешанного пола на разных стадиях развития.(B) То же, что и в (A), с использованием реплик дикого типа и наборов данных мутантных или РНКи.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.s001
(EPS)
S2 Рис. Сбор и экспрессия в ранних эмбрионах.
(A) Репрезентативные изображения из ранних коллекций эмбрионов показывают эмбрионы, которые были зафиксированы метанолом и окрашены DAPI. Внизу показано распределение количества ядер в коллекциях ранних эмбрионов гермафродитов (левая панель) и смешанного пола (правая панель).(B) Гистограммы показывают распределение log 2 кратных различий между гермафродитными и смешанными половыми ранними эмбрионами на Х-хромосоме (левая панель) или аутосомах (правая панель). Дифференциально экспрессируемые гены (DESeq2, padj <0,05) показаны темно-серым цветом.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.s002
(EPS)
S3 Рис. X и выражение аутосомного сигнального элемента.
(A) Значения экспрессии (FPKM) для каждого из известных и картированных XSE и ASE показаны в наборах данных последовательности мРНК гермафродитов и смешанного пола.Планки погрешностей представляют собой относительную стандартную ошибку среднего значения для биологических повторов. (B) Значения экспрессии из наших данных об эмбрионах согласуются с данными, опубликованными для гермафродитных эмбрионов с большим временным разрешением [30]. Показаны два репрезентативных гена.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.s003
(EPS)
S4 Рис. Анализ
dpy-27 РНКи и dpy-21 мутантных червей.(A) Типичное распределение стадий для эмбрионов смешанной стадии, выделенных из взрослых беременных путем отбеливания.(B) Снижение уровней белка DPY-27 на dpy-27 РНКи. Вестерн-блоттинг показывает уровни белка DPY-27 в коллекциях РНКи и контрольных векторов. Процент нокдауна рассчитывали путем сравнения сигнала DPY-27 в РНКи с векторным контролем с использованием тубулина в качестве отрицательного контроля. (C) mRNA-seq log . 2 -кратных изменений между мутантными и дикими эмбрионами раннего типа были сгруппированы с использованием кластеризации k-средних. У ранних эмбрионов транскрипционные эффекты dpy-27 (y56) и dpy-21 (e428) были более отчетливыми на Х-хромосомах по сравнению с эмбрионами смешанной стадии и личинками L3.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.s004
(EPS)
S5 Рис. Соотношение полов и влияние
dpy-27 и dpy-21 на недавно экспрессированные кластеры генов для генов, которые высоко экспрессируются у обоих полов.Значения экспрессии гермафродитов для последовательных временных точек развития были сгруппированы, и кластеры генов, активированных в более старой точке, были идентифицированы и отмечены звездочкой. Новые и высокоэкспрессированные гены были идентифицированы путем взятия тех, которые не были экспрессированы в более ранний момент времени (FPKM <1), и высоко экспрессируются в последующий момент времени (FPKM> 10).Логарифм гермафродитов / смешанного пола 2 соотношений экспрессии, log 2 кратных изменений при dpy-27, ( y56 или RNAi) и dpy-21 (e428) показаны для X и аутосом. Для сравнения также показаны соотношения для всех высоко экспрессируемых генов.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.s005
(EPS)
S6 Рис. Корреляция между наборами данных ChIP-seq.
(A) Коэффициенты парной ранговой корреляции Спирмена между каждым повторением данных ChIP-seq были рассчитаны из среднего обогащения ChIP-seq в окнах размером 1 kb, расположенных по всему геному.Корреляции были иерархически сгруппированы и представлены в виде тепловой карты. (B) То же самое для пика в данных ChIP-seq с использованием однозначно отображенного C . elegans читает.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.s006
(EPS)
S7 Рис. H5K20me1 ChIP-seq анализ экспрессии генов в смешанных эмбрионах.
(A) Показатели обогащения h5K20me1 ChIP-seq были нанесены на график по сайтам начала транскрипции (TSS) у дикого типа и dpy-21 и set-4 мутантных L3 (верхние 3 графика) и смешанных эмбрионов (нижние 3 графика) .Данные были усреднены для экспрессированных (верхние 20% по mRNA-seq в N2) и молчащих (нижние 20%) генов на Х-хромосоме (красный) и аутосомах (синий). (B) Всплеск скорректированного обогащения h5K20me1 хромосомой, такой же, как на рис. 7C, но для смешанного набора данных эмбриона. Модель демонстрирует накопление h5K20me1 у мутантов set-4 (n4600) у смешанных эмбрионов и личинок дикого типа. (C) Обогащение DPY-27 ChIP, усредненное по всем аннотированным Wormbase стартовым сайтам транскрипции (WS220) или недавно аннотированным GRO-seq определенным стартовым сайтам [43].Связывание DPY-27 было немного снижено в dpy-21 (e428) и не изменилось у мутантов set-4 (n4600) .
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.s007
(EPS)
S8 Рис. Корреляция и нормализация пика мРНК-seq в наборах данных.
(A) Коэффициенты парной ранговой корреляции Спирмена между значениями экспрессии мРНК-seq, рассчитанными на основе уникального картирования C . elegans и C . briggsae читает.(B) Верхний левый график показывает корреляцию экспрессии гена для высокоэкспрессируемого шипа C . briggsae гена, как среднее число считываний из трех повторов. Коэффициенты линейной регрессии из подгонки (красная линия) были скорректированы, чтобы соответствовать выражению равенства (серая линия), и скорректированные значения были нанесены на график на верхней правой панели. На нижней левой панели показана экспрессия гена C . elegans гена дикого типа и мутанта до исправления. Нижняя правая панель показывает экспрессию гена после коррекции с коэффициентами линейной регрессии, рассчитанными для C . briggsae всплеск экспрессии.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005698.s008
(EPS)
.